蛋白质与蛋白组学

非常感谢你的意见！！！
首先我的蛋白是从培养的肝癌细胞培养出来的，提蛋白的东西是买试剂盒，pierce的，M-PER® Mammalian P rotein Extraction Reagent，25平方厘米的细胞培养瓶，细胞长到80~90%，PBS洗三次，每次5毫升，然后用胰酶把细胞消化下来，放到离心管中，8000转5分钟，弃上清，加7毫升PBS，混匀，8000转5分钟，弃上清，再加7毫升PBS，混匀，8000转5分钟，弃上清，加提蛋白的那瓶东西，200微升，混匀，震荡，5分钟后，将这些液体移到1.5EP管中，常温，12000转10分钟，取上清，分装，-20℃保存，留一点BCA法测蛋白量，测得3~4微克这样。
这些蛋白三天后拿来做WB，100微升蛋白+25微升上样缓冲液，煮沸5分钟，常温冷却，上样量是30微升。
转膜液是用别人的（别人做得出来的），自己配的不敢用了。转完膜后能在膜上看到mark。
转膜的时候，夹子的黑面我放在下面，接着是一层海绵，三层滤纸，胶，PVDF膜，三层滤纸，一层海绵。
康城的内参是用一个老师的，别人也是用他的，也跑得出来，但是，是配好后分装几管，每次用完后放-20摄氏度保存，要用的时候才拿出来融。
目的我还没做，一抗是买sigma的，拿来做免疫组化，效果也不是很好~
ECL试剂盒是碧云天的，1：1配制，每次加完后，都没见过荧光。
我现在很纳闷啊！步骤的话，我跟周围的老师和同学说了，他们都说跟他们做的都一样的~
最后还是很感谢你的答复！

===============================================================================================================

你细胞蛋白都上了72ug？我做全细胞蛋白一般上10ug就足够了。如果蛋白太多也会出现白板的，因为ECL刚滴到膜上就消耗殆尽了。另外你怎么看“荧光”的？在暗室压片么？化学发光和荧光是不一样的哦，你用错了仪器也是白板哦。

是两种染色剂，粉末状的，具体你可以上网查一下，将你二抗结合后的膜TBST洗三次后，将膜放入10mlAP底物缓冲液（Nacl 2.9256g，Mgcl2 0.5.64g用0.1M的Tris溶解至500ml），66ulNBT,33ul BCIP混合液中染色，十分钟差不多就能看到目的条带了，染色时间长点没事

===============================================

谢谢你的回复！
这样染出来的膜，直接用相机照相就行了？不用成像仪拍？

你细胞蛋白都上了72ug？我做全细胞蛋白一般上10ug就足够了。如果蛋白太多也会出现白板的，因为ECL刚滴到膜上就消耗殆尽了。另外你怎么看“荧光”的？在暗室压片么？化学发光和荧光是不一样的哦，你用错了仪器也是白板哦。

==============================================================================================================

谢谢你的回复！
因为之前老师说我的蛋白提得太少了~说我算的不对！让我加30微升，最大量~那照你说的话，上样量10~20微升就够了是吗？
如果“如果蛋白太多也会出现白板的，因为ECL刚滴到膜上就消耗殆尽了”出现这样的情况的时候，加了发光剂后，关掉红外灯的情况下能看到荧光吗？
所谓“荧光”是在暗室压片的时候，加了发光剂，关掉红外灯之后，在膜上看到的光。我也不知道叫“荧光”对不对，就是听见大家都这么说，我也就……呵呵~

谢谢你的回复！
因为之前老师说我的蛋白提得太少了~说我算的不对！让我加30微升，最大量~那照你说的话，上样量10~20微升就够了是吗？
如果“如果蛋白太多也会出现白板的，因为ECL刚滴到膜上就消耗殆尽了”出现这样的情况的时候，加了发光剂后，关掉红外灯的情况下能看到荧光吗？
所谓“荧光”是在暗室压片的时候，加了发光剂，关掉红外灯之后，在膜上看到的光。我也不知道叫“荧光”对不对，就是听见大家都这么说，我也就……呵呵~

=======================================================================

ECL有没有问题啊？我无解了，压片是最敏感的方法了，其他方法你也可以尝试，祝好运~