【讨论帖】朊病毒 - 经验共享

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标题:【讨论帖】朊病毒

leifengta[使用道具]
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发表于 2013-11-11 15:54 资料个人空间短消息加为好友

小中大

cuturl('http://www.bio.vu.nl/thb/users/ingeborg/PrionImages.html')

编辑一下，想直接让网页的图版显示出来，可是这个网站是个荷兰的，太慢。就贴几张图片上来吧。

这张是具有感染性的朊病毒蛋白的结构图，注意是以折叠为主：

附件

2013-11-11 15:54

12684741.gif (22.84 KB)

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发表于 2013-11-11 15:55 资料个人空间短消息加为好友

小中大

不知大家有没有时间读一下上面推荐的 nature 上关于 “prion 复制需要小分子RNA的参与” 这篇文章？

文章一点不难，而且要证明的事情很简单：具有感染性的朊病毒蛋白在复制时需要RNA分子的参与。

希望大家都一起读一下。想组织一下讨论，但讨论文章在丁香园还是头一回，没太想好怎么讨论。过往的朋友帮忙想一下，如何让大家讨论起来呢？我有几个没想好的：

1。用不用全文翻译？
2。是译为主还是讨论实验方法为主？
3。有多少朋友能参与讨论？大家能投入多少时间？（我可以帮忙找背景材料，如果参与讨论的朋友不懂哪一步可以提出来，我不行还有别人行呢Smile）

对积极参与者，因为占了积极，又有共同尝螃蟹的功劳，有价值的发言三分一贴，比较有价值两分，一般贡献一分相赠。其实分数不是重要的，希望大家能投入进来，真心希望能在蛋白版与大家共同进步/color]

[ 本帖最后由 wiwi 于 2013-11-11 16:01 编辑 ]

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发表于 2013-11-11 16:01 资料个人空间短消息加为好友

小中大

相关疾病：
感染
文章来源：Nature 2003 Oct, vol 425, page 717-720

题目：RNA molecules stimulate prion protein conversion

先把我上面的问题 hang on 着，欢迎大家在文章讨论的同时随时提出宝贵意见，您的参与是对我最大的支持和鼓励！一篇文章的讨论并不是最重要的，最重要的是想通过这种形式，来帮助大家学会怎么阅读论文，怎样通过阅读别人的文章来build up 自己的科研思维。（也许话说得大了些，大体上是这个意思吧）

下面我就简单介绍一下这篇文章的内容。

文章的假设直接指向：具有感染性的朊病毒的复制需要小分子特异性RNA的参与

文章所用条件：体外

（对体外模型当然有不周到的地方，对此，在文章介绍中第一句就提到：We previously showed that PrPres amplification in vitro shares many specific features with the pathogenic process of prion propagation in vivo, including strain and species specificity. 这里还特意指明了，研究结果表明不同种属来源的朊病毒和朊病毒的不同strain 性质相似。附件的图版是不同鼠体内朊病毒的构象相似状况，请看一下）

主要实验技术：跑胶（蛋白胶和核酸胶）

（方法十分简单，这也验证了一些说法：NATURE或SCIENCE上的文章，实验方法可以很普通，主要在创意。如果我们中的谁想到了一个好主意，只加了加热，也一样可以发在NATURE，SCIENCE 上SmileSmile）

请大家注意一下：这篇文章主要讨论的是有感染性的朊病毒的复制过程，而上面我们讨论过的更多是关于无感染性朊病毒到有感染性的“构象转变”，所以请不要混淆了。

文章based on 的一些理论依据是：有感染能力的朊病毒的复制不需要核酸（一些实验证据表明的）；构象翻转机制现在还不清楚。

文章的思路：被朊病毒感染的Hamster （一种大鼠，仓鼠？）的脑匀浆与健脑匀浆混合，三十七度过夜，测具有感染性的朊病毒蛋白的增殖（diluted prion-infected brain homogenate (0.1% w/v) is mixed with either 5% (w/v) normal brain homogenate or buffer control and incubated overnight at 37 oC. Hamster Sc237 PrPres is amplified about sixfold under these conditions ）；为了证明不是蛋白酶、核酸酶、双链小RNA、DNA与RNA杂交体、单核苷酸的作用，分别把它们的抑制剂或降解试剂加入，再跑胶，看是否对复制有影响

文章结论：

-- 有感染性朊病毒体外复制需要特异性小RNA分子的参与

-- 哺乳动物RNA有作用，而非脊椎动物的RNA不行

-- 有感染性病毒的复制过程中，宿主的RNA可能参与了构象翻转

文章有很多疑点，希望大家按着这个思路读一下，我们一起讨论一下这篇文章。时间很多，我们可以讨论一个月，两个月。文章讨论时贵精不贵多，有了思路和方法以后就好读多了。

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发表于 2013-11-11 16:02 资料个人空间短消息加为好友

小中大

相关疾病：
感染
这是来自不同物种：mouse, hamster 的朊病毒的构象（从多螺旋结构看来应该是不具感染能力的），很相象。

附件

2013-11-11 16:02

41388716.snap.jpg (40.42 KB)

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发表于 2013-11-11 16:03 资料个人空间短消息加为好友

小中大

问题题面：benzonase 是一种什么酶？酶切作用特点？

--题目提示：文章中没有说，可以在查询资料--

feima+[使用道具]
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发表于 2013-11-11 16:03 资料个人空间短消息加为好友

小中大

Benzonase

<enzyme> Product of genetic engineering which hydrolyzes both DNA and RNA; from serratia marcescens(粘质沙雷氏菌);both Dnase and Rnase activity.
Synonym: benzon nuclease, ben endonuclease
Benzonase® - The smart solution for DNA removal
For the first time, an effective biochemical method is available for removing DNA and RNA from laboratory and industrial scale bioprocesses. It is called Benzonase® endonuclease.
Benzonase® is a unique, genetically engineered endonuclease offering a variety of advantages over existing methods of nucleic acid removal.
Benzonase® endonuclease has proven its value in the laboratory for well over ten years and is successfully applied in the pharmaceutical and biotechnological industry in the downstream processing of biopharmaceutical actives e.g. monoclonal antibodies, virus vaccines, gene therapy and recombinant proteins from E.coli.

Benzonase® is applied whenever the presence of nucleic acids might cause interference i.e.

• Purification and characterisation of proteins, and peptides
• Purification of antibodies and viruses for therapeutic use
• Safety of biopharmaceuticals

FDA guidelines for the manufacture of recombinant biological entities for therapeutic use demand that nucleic acid contamination should be limited to 10 pg per dose. Benzonase® - alone or in combination with other steps - offers a powerful and well-accepted tool to achieve regulatory requirements.
Benzonase® is covered by several patents, i.e. US Patent No.5,173,418, EP Patent No.0229866 B1

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发表于 2013-11-11 16:04 资料个人空间短消息加为好友

小中大

第二个问题：micrococcal nuclease 是什么酶，作用特点？

既是第二个问题，加一点点难度：除了用英文，用部分中文解释一下。

问题提示：同第 1 题，文章中没有，可查资料回答。

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发表于 2013-11-11 16:04 资料个人空间短消息加为好友

小中大

起源 : Staphylococcus aureus菌体的培养液
概述
Micrococcal Nuclease-------微球菌核酸酶(MNase)是一种内切核酸酶，作用于单链及双链核酸[包括DNA 和RNA <icesugar75注>]，生成3'磷酸末端。对单链核酸的作用较好，能较好地分解DNA或RNA的富含AT或AU区域。本酶不需要Mg2+,其催化作用需要Ca2+的存在。

活性定义: 以热变性小牛胸腺DNA作底物，在37℃，pH8.0的条件下，30分钟内生成1 OD260的酸可溶性物质的酶的活性定义为1 U。
纯度 50 U的本酶和1 μg的λ-DNA在Mg2+存在下37℃反应10分钟，DNA的电泳谱带不发生变化 .SDS电泳表现95%以上的纯度。
使用注意 : 本酶的活性严格依赖于Ca2+的存在，用EDTA或EGTA可以终止反应。
用途: 细胞粗抽提液中核酸的水解。
为制备核小体 (Nucleosome) 时消化分解染色质 (Chromatin)
参考资料：
Pelham, H. R. and Jackson, R. J., Eur. J. Biochem. 67, 247 (1976).
Noll, M., Nature 251, 249 (1974).
Heins, J. N. et al., Proc. Nucl. Acids Res. 1, 79 (1976).

Ye, X. et al. Defective S phase chromatin assembly causes DNA damage, activation of the S phase checkpoint, and S phase arrest. Mol. Cell 11, 341-351 (2003) | PubMed |

Mujun Zhao*, Zhenyu Wu, Wenlin Chen, Tsaiping Li:“The Biological Significance of Micrococcal Nuclease (MNase) hypersensitive sites of rRNA chromatin template of Silkworm Attacus ricini”， Molecolar Biology of the Cell. Vol.10, (Sup) pp.282a, 1999

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发表于 2013-11-11 16:06 资料个人空间短消息加为好友

小中大

Benzonase is a genetically engineered endonuclease which degrades both DNA and RNA strands in many forms to small oligonucleotides. It promotes quick reduction of the viscosity of cell lysates, which facilitates ultracentrifugation and increases the capacity and life of chromatography columns. It saves time, reducing proteolysis and increasing the yield in targeted protein and offers complete elimination of nucleic acids from recombinant proteins.
来源:cuturl('http://www.oswel.com/code/en/mod_38.htm')

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小中大

我注意到这篇文章不是以article而是以letter形式刊登的，所以觉得Nature的编辑还是相当慎重的。蛋白质折叠的问题是中心法则的最后堡垒。现在如果能弄清楚新生肽如何折叠，无疑将是最的重大突破。但是我们研究蛋白质时，大多是进行的体外实验，当然这符合先把问题简单化然后再把问题复杂化的顺序，可体内和体外的差别很大，如我以前发的一个帖说生物大分子的拥挤环境对蛋白质的影响一样，现在人们对体内生物大分子环境如何影响蛋白质的折叠越来越关心。所以，PrP如何完成折叠，体外和体内还是有些区别，特别是要考虑到体内免疫系统的参与，考虑到体内生物大分子拥挤环境的参与，也许确实需要小分子RNA，更有可能的RNA的背后还藏有别的分子，就合DNA的复制、转录一样，除了核酸外，有为数众多的小分子参与。

附：一些关于蛋白质折叠的观点
在试管中做蛋白质折叠实验的条件往往人为简化或不得不简化，与新生肽在细胞内折叠的条件有质的或量的差别。所有的细胞中都存在着大量的蛋白质、核酸、多糖等各种生物大分子，它们大约占用细胞容积的20－30％，总浓度高达每升80－200克，因此任何一种大分子都处于一个充满其他大分子的“拥挤”环境中，使得任何一个大分子的实际可及空间大大减少，这种情况对所有大分子之间的反应在热力学和动力学上都有很大的影响。最近，有人呼吁，在体外研究蛋白质折叠必须考虑模拟细胞内的“拥挤”环境。此外，某一种蛋白在某一时刻在细胞内的局部浓度可以非常高，这样高浓度的蛋白质在试管中必然发生聚集而不可能完成折叠。所以，在体外进行的实验，为了提高蛋白折叠效率，并且有利于进行分析，实验所用的蛋白浓度总是很低的；温度也常在37摄氏度以下，有时低到10摄氏度以下，以减缓反应速度。溶液成分也尽量简单，便于分析。
1988年，邹承鲁明确指出，新生肽段的折叠在合成早期业已开始，而不是合成完后才开始进行，随着肽段的延伸同时折叠，又不断进行构象的调整，先形成的结构会作用于后合成的肽段的折叠，而后合成的结构又会影响前面已形成的结构的调整。因此，在肽段延伸过程中形成的结构往往不一定是最终功能蛋白中的结构。这样，三维结构的形成是一个同时进行着的，协调的动态过程。

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