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标题:【讨论帖】朊病毒

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第 3 个问题:再加些难度

讲一下 RNase A, RNase T1, RNase V1, RNase H 的作用特点,包括相同点和不同点。

问题提示:都是RNase, 都可降解 RNA,具体能降解何种形式的 RNA 呢?单链的,双链的,还是长的,短的?降解产物是长的,短的,还是有什么末端特征的?-- 文章中只有星点线索,推荐网上查找资料。
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RNase H: 起源
Escherichia coli HB101 containing E. coli rnh plasmid (pKH11) and regulator plasmid (pNT203)
概述
RNase H是特异性分解RNA-DNA杂交体中的RNA链的核糖核酸内切酶,产生具有游离3'-OH和5'-磷酸末端的产物,该酶对单链的核酸、双链DNA或双链RNA不起作用。
一般性质 分子量 21,000 最适pH pH8.0附近 活化剂 Mg2+或Mn2+
活性定义 以Poly(rA)·Poly(dT)为底物,在30℃、pH7.7的条件下,20分钟内产生1 nmol酸可溶性物质所需要的酶量定义为1个活性单位 (U)。
用途 :
通过Okayama-Berg法进行cDNA Cloning。
DNA-RNA杂交体的检定。
在Oligo(dT) 存在下除去mRNA的Poly(A) 末端。
mRNA的定量。

Remove RNAs. For isolate highly pure plasmids ideal for transfection or automated sequencing

RNase A, Bovine Pancreas
核糖核酸酶A(牛胰)
概述:
核糖核酸酶A是内切核糖核酸酶,可特异地攻击RNA上嘧啶残基的3'端,切割与相邻核苷酸形成的磷酸二脂键。反应终产物是嘧啶3'磷酸及末端带嘧啶3'磷酸的寡核苷酸。
来源:牛胰。
DNase活性去除:
将固体RNaseA溶于10mM Tris-HCl,pH7.5,15mM NaCl缓冲液或灭菌水中,在100℃煮沸15min后在室温缓慢冷却。
应用:
1. 从DNA:RNA杂交体中除去杂交的RNA区。

RNase Cleavage Site
A 3' of ss C's and U's
V1 base-paired nucleotides
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从这里进入可以找到RNase A或 V1 的许多相关作用介绍
cuturl('http://www.ambion.com/catalog/CatNum.php?2275')
cuturl('http://www.ambion.com/techlib/tn/92/9214.html') [icesugar75 添加]

RNase A cleaves 3' of single-stranded C and U residues. RNase V1 cleaves base-paired nucleotides

Ribonuclease T1 (RNase T1) is an endoribonuclease that specifically cuts RNA or deaminated RNA at the 3’-end of guanosine residues and adjacent nucleotides through a 2’, 3’-cyclic phosphate intermediate mechanism. Epicentre’s RNase T1 is cloned from Aspergillus oryzae and over expressed in E. coli to produce a highly pure enzyme without contaminating DNase or non-specific RNase activity. [icesugar75 补充]

这是一个例子(附件中):Structural Analysis of an RNA.
The RNA molecule shown above was end-labeled and subjected to digestion with RNases A, TI, and VI. The resulting fragments were visualized by denaturing PAGE.


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下面来小结一下:

为了让大家充分理解文章中第一个figure 的意义,我们已经做了不少准备工作。首先就是关于不同类型的 RNase。因为文章要研究的是RNA与prion 复制的关系,所以什么样的RNA,单链双链,长链短链,与结果息息相关。

研究RNA二级结构的酶主要用了RNase H,RNase V1, RNase T1. 这几种酶作用特点各有不同,milkmoon 的介绍非常详尽,有一个小小的图表传上来,希望有利于大家查看:

RNase H 特异性分解 RNA-DNA 杂交体中的 RNA,对单链的核酸、双链DNA或双链RNA不起作用。


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好了,我们做了这么多准备,现在来看看文章的第一个图做了些什么实验:

图1A:用RNase (DNase-free); RNase A; RNase T1; Micrococcal Nuclease; Benzonase 分别加入复制反应体系中,观察这些酶的加入,对有感染性朊病毒蛋白复制的影响。酶是不同稀释度的。

Note for your convenience:

--- RNase A: 降解 DNA 和 RNA 杂交产物中的RNA
--- RNase T1: 降解 RNA
--- Micrococcal nuclease: 同时水解DNA 和 RNA (无论单双链)
--- Nenzonase: 同时水解DNA 和 RNA (无论单双链)

注意:
1。方法是蛋白跑胶做 Western Blot
2。第一行中所使用的 RNase 种类没有提及;

从图1A中可以看出文中给出的结论:prion 的复制是不依赖DNA 而是RNA的,而且是 RNase 剂量依赖的。

现在提出第 4 个过关问题:

既然文章用 western blot 做蛋白质定量,从图1a 看来,它缺少了哪一个重要的对照?

Bonus Question: 有没有任何文献证实,分子量处于25KD 和37 KD 的prion 蛋白是具有感染性的蛋白质?---- 依提供文献和论证的有效性


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相关疾病:
朊蛋白病Kuru病感染
楼主都引导到这里了,随便说说:Tongue 是不是缺少DNase作用后的一组结果!Wink不过或许思维有误![不是思维有误,这部分实验在图1b 呢。icesugar75 注]

“都怕别人以为跟你是一伙儿的了” 莫怕,莫怕!我只是为了学习,在你提出问题之前我还没有太多的考虑,这样可以增加认识,但是提出问题是更可贵的,因为你已有了答案。。。。。。[我哪里的答案,一起讨论嘛Smile,icesugar75 注] Big SmileBig SmileBig Smile

另外提一下“分子量处于25KD 和37 KD 的prion 蛋白是具有感染性的蛋白质”对这个不应该提出太大的疑问,如果这个显然的问题没得到大家在很多未知的前提下的一种默许的话,Shy这篇文章未免。。。。。。[没见这方面的材料啊,很难讲的。 icesugar75 注]

我随便浏览了一下,捏来一点:

海绵状脑病 本病为一组疾病,其共同特点是脑灰质疏松呈海绵状,其中亚急性海绵状脑病和Kuru病可见于人类和灵长类。此类疾病的病原体为小分子量(60000)的糖蛋白称为Prion(Pr)。Pr是正常神经元的膜蛋白,本身并不致病。如其结构发生一个氨基酸的变异,形成Pr5C则不能被蛋白酶完全降解,形成Pr27-30。后者形成类淀粉蓄积于神经元胞体内,造成神经元死亡。Pr27-30感染(接种)于另一个体可起模板作用,进行大量复制,造成疾病蔓延。Kuru病仅发生在大洋洲巴布亚新几内亚,由于食人尸脑而传播。革除陋习后此病几乎已绝迹。

Priori的微生物学特征

  一、理化性质;Prion具有非常的理化特性,能使核酸失活的物理方法(如煮沸、紫外线照射、电离辐射等)和化学方法(如核酸酶、羟胺、锌离子作用)对其均无影响,Prion感染后的提纯制备物亦测不到核酸,但许多蛋白质变性剂可使其感染性不可逆地失活。因此,Prion是一种缺乏核酸的蛋白质因子。

  二、生物学特性;Prion是一分子量为33kD~ 35kD的糖蛋白,Prion蛋白(prion protein,Prp)由 254个氨基酸组成(人类Prp为253个氨基酸)。研究发现,Prp存在异构体,既Prpc和Prpsc。Prpc是存在于正常组织的功能还不清楚的糖蛋白,对蛋白酶敏感,不致病,Prpsc分子量为27kD一30kD,对蛋白酶有抗性,是可致病蛋白质。在正常脑组织中只有Prpc,没有Prpsc,而患病大脑中则既有Prpc,又有Prpsc。尽管这两种Prp的氨基酸序列相同,但其立体构象却不一致。Prpcα螺旋高达42%,β片层仅 3%,而Prpsc却相反,α螺旋仅3%,而β片层则高达43%。这种构象的差异导致了化学性质和生物学作用的明显不同。Prion不含核酸,它如何复制,现尚无定论。

  三、分子生物学:不论动物抑或人类,Prion由宿主染色体上一个单拷贝基因编码,人Prion基因 (PRNP)位于20号染色体的短臂上,小鼠Prion基因则位于2号染色体上。人PRNP的突变常发生在第32、48、56、72位密码子处,多为重复片段的插入或点突变,突变的结果是使Prpc分子转变成Prpsc。

  Prion的传染性与遗传性
  Prion不仅有传染性,而且有遗传性。(临床内科杂志,4:169;1999)
cuturl('http://www.xssc.ac.cn/discussion')
cuturl('http://medicine.bjmu.edu.cn/department/biophysi/biophysics/LAB/NewSNL/training%20course/reviews/TSE97review.pdf/applydetail.asp?rno=505&cla=C0')

  
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相关疾病:
牛海绵状脑病
谈一点PrPc的功能

Prion的编码基因为PRNP,编码PrPc和PrPsc两种蛋白质,两者构象不一,PrPsc为疯牛病的病原体。虽然大多数的文献一提到PrPc就说其功能还不明确,但实际上近年来对PrPc功能的研究还是有一些进展的,归纳如下:
1、PRNP基因敲除的小鼠出现异常的睡眠模式和电生理特性,并且对药物诱导的癫痫的敏感性增加;
2、PrPc能与Cu离子结合,能调节胞内Cu/Zn超氧化物歧化酶的功能,与细胞的氧化应激反应有关
3、PrPc能激活Lyn、Syk、Fyn等激酶继而进一步激活PKA、PKC、PYK2等下游分子
4、PrPc有抑制神经细胞凋亡的作用
5、目前已经鉴定了多种与PrPc相互作用的蛋白质,包括heparin-like compounds、 the neuronal phosphoprotein synapsin Ib、Grb2、 Pint1 、Laminin、stress-inducible protein 1等。
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有没有任何文献证实,分子量处于25KD 和37 KD 的prion 蛋白是具有感染性的蛋白质?---- 依提供文献和论证的有效性

==============================================================================================================

谈一谈自己的看法,相关的和不相关的。prion 蛋白由254个氨基酸组成,其分子量应为26-27Kd,但由于prion的180位和196位有糖基化位点可被糖基化修饰,的实际分子量为33Kd左右,用经典的prion 蛋白抗体3F4(Sigma)进行WB可以证实。PrPc和PrPsc的大小都是33Kd,但可以通过蛋白酶K试验进行区分,PrPc进行蛋白酶解后不能被3F4抗体检测到,而PrPsc耐受蛋白酶K的作用。

prion 蛋白的结构已经研究得较清楚,列如下:
1-23aa:信号肽序列
23-90aa:脂筏靶向信号
51-90aa:8肽重复序列(与Cu离子结合部位)
180aa and 196aa:糖基化位点
112-145aa:疏水区
178aa和213aa形成二硫键
231-252aa:GPI锚定信号肽
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相关疾病:
感染

我对单独跑胶来判断分子量大小可以,但是,如何知道:

1。它是由原蛋白复制得来的?
2。它仍然保持其模板的感染活性?(cloner 已经解决了这个问题,下面的贴子画红加黑的部分Smile)

我们在前面的资料中可以看到,朊病毒蛋白的致病形式与非致病形式只是构象不同,是否有这种可能,复制后的蛋白就不具有感染能力了呢?

先把这个问题 hang on 在这里,哪位朋友有了想法或答案定来告知!

==============================================================================================================

prion 蛋白由254个氨基酸组成,其分子量应为26-27Kd,但由于prion的180位和196位有糖基化位点可被糖基化修饰,的实际分子量为33Kd左右,用经典的prion 蛋白抗体3F4(Sigma)进行WB可以证实。PrPc和PrPsc的大小都是33Kd,但可以通过蛋白酶K试验进行区分,PrPc进行蛋白酶解后不能被3F4抗体检测到,而PrPsc耐受蛋白酶K的作用。

===============================================================================================================

你的意思是:用一定的抗体可以识别有感染性的朊病毒,而没有感染性的不可被检测,是吗?不知这种说法是否有依据。从实验步骤看来这一步是技术关键。
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我们来看一下 图1b:对朊病毒蛋白复制没有影响的一组酶

-- RNase V1:水解双链RNA
-- RNase H:水解 DNA-RNA 中的单链 RNA,对其它类型核酸没有作用
-- DNase: 没有 specify 到底是哪一种
-- EcoRI:降解 DNA 常用酶
-- Apyrase:腺酸水解酶,能将腺三磷酸(ATP)及腺双磷酸(ADP)水解成腺单磷酸(AMP)及无机磷
-- Heparinase III: 肝素酶

前四种酶的使用很好理解,排除了DNA-RNA,dsRNA, DNA 在复制系统中的作用。

用 apyrase 的目的是:排除高能量ATP, ADP 在系统中作用的可能。因为大家都知道,水解核酸时会产生这些小分子,是否这些小分子在系统中起作用,这个考虑很重要。
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