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标题:HPLC 基本维护故障诊断交流讲座

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HPLC 基本维护故障诊断交流讲座

 1.判断仪器脱气机是否正常:打开purge阀,流速设为2ml/min,然后提起过滤头,让体系进一些空气,再放下过滤头,看气泡是否会减少来判断脱气机是否起作用;

  2. 溶剂过滤头不可超声清洗,可用35%硝酸浸泡1小时后再用溶剂清洗;

  3. EDTA、乙二胺四乙酸等会对液相柱的不朽钢产生腐蚀;四氯化碳与2-异丙醇、四氢呋喃不可混合使用,但可单独使用;

  4. 溶剂的使用:每两天更换或重新过滤溶剂(尤其是水,需要每天更换);流动相过滤是为了去除微生物,一般水要放在棕色瓶中;

  5. 判断purge阀的滤芯是否需更换:用水作流动相时,流速为5ml/min时,正常泵压应为0bar(若打开purge阀时,泵压超过10bar时需更换滤芯);

  6. 若用非极性溶剂作流动相,则需更换泵中起密封作用的“黑草帽”(适合反相的材料为石墨+聚四氟乙烯,而适合正相的为 ),而且必须一对同时更换,否则损坏更快;

  7. 密封垫的冲洗:当流动相中盐的浓度>0.01M时,可减少密封垫的磨损;用1%异丙醇溶液冲洗活塞杆中析出的盐(加异丙醇是为了防止细菌生长),流速设为3-5滴/min;泵开着,洗盐装置也须开着;

  8. 泵头不可用超声清洗(可用乙醇、水清洗)、宝石杆不可超声,石英窗可用超声清洗;

  9. 缓冲盐的通道放在比例阀的下面,只有两相的话,只用一边(盐在下面,有机相在上面);

  10.双元泵为泵后混合方式(为高压混合方式,不易进气泡),而四元泵为低压混合方式;

  11.出口球型阀(outlet ball valve)可用超声清洗;

  12.双元泵有一个筛网(sieve)可控制低流速;

  13.流动相使用了缓冲盐,则必为反相柱(不可长时间用水冲),一般可冲20-30min,然后加入有机相(如甲醇),浓度逐步加大,直至100%甲醇;

  14.反相和正相转换时,一般要做溶剂过渡(最佳为异丙醇),因为粘度大,流速不可设太大,不要超过 1ml/min(完全置换原来溶剂所需溶剂体积=体系体积(柱体积+1.5ml)×5);

  15.比例阀内漏:抬起有嫌疑的通路,看管内流动相体积是否减少(抬起时同时打开purge阀);

  16.泵压力不正常可能原因:气泡、主动阀故障、出口阀故障、密封垫或柱塞杆磨损,渗漏或堵塞、比例阀故障、传感器故障、使用比例阀混合时盐浓度太高;

  17.自动进样:旁路状态、主路状态;手动进样:load状态至inject状态(最好满刻度进样,建议吸3倍以上进样体积),小体积进样则以小于1/2进样阀体积为佳;平时进样阀最好保持在inject状态(最右边状态);

  18.进样流程:插针——inject状态——load状态——进样(缓慢)——inject状态——拔出针(进样阀后有两根废液管);

  19.VWD(可变波长)检测器:检测器后out废液管不可太短,否则流通池容易进气泡,也不可太长,否则易压碎流通池;

  20.DAD检测器(优势为优化条件方便):最大波长选择——要选择溶剂没有吸收的位置(避开约20nm);VWD检测器的灵敏度略高于DAD检测器;滤光片中钬玻璃用于校准波长;若要检测器的灵敏度提高则要开大狭缝(二极管阵列前狭缝默认为4nm);

  21.DAD检测器的氘灯可用于VWD检测器,但反之则不行;钨灯、氙灯寿命长,可随开随用,但“氘灯需要预热(10几分钟)(寿命为1000小时),1-2小时不用,不用关,还是开着更好,氘灯放时间长容易衰变”,灯可进行测试;

  22.测定条件设定:reference wave(流动相中溶剂的吸收)可以不设,梯度洗脱时参考波长要设,否则会导致基线漂移,DAD可选一个样品没吸收的波长作为参考光;band width(VWD设为光谱的半谱带宽度,而DAD检测器则不用设)(此范围内作色谱图可降低噪音,信噪比更好,但信号会降低);参考波长选择原则:样品没有吸收,但靠近样品最大吸收的位置;参考光波长带宽必须大于或等于测量光波长带宽;DAD选条件时要存所有光谱图(spectrum);氘灯(190-800nm),但有效范围为190-600nm,钨灯(470-950nm),若用470-800nm时两灯同开则强度加大;

  23.基线噪音大原因:泵压不稳、有气泡、柱污染

  24.清洗在线脱气机及比例阀(尤其是长期使用水相或缓冲盐的通路):先用水冲洗,再用甲醇冲洗,可以打开purge阀,使用5ml/min的流速,也可用IPA清洗:A、Buffer B、MeoH C、Water D、CH3CN 分析:A:B=20:

  25.流动相pH>9.5或<2.3时,进样阀应更换tefzel转子密封,可耐受压:VWD(40bar),MWD(120bar), FLD(20bar), RID(56bar);RID,FLD永远是最后一个检测器

  1.HPLC的日常操作条件: 温度:10—30℃; 相对湿度《80%; 最好是恒温、恒湿,远离高电干扰、高振动设备。

  2.泵的保养:

  1)使用流动相尽量要清洁;

  2)进液处的沙芯过滤头要经常清洗;

  3)流动相交换时要防止沉淀;

  4)避免泵内堵塞或有气泡;

  3.进样器的保养:

  1)每次分析结束后,要反复冲洗进样口,防止样品的交叉污染;

  4.柱的保养:

  1)柱子在任何情况下不能碰撞、弯曲或强烈震动;

  2) 当柱子和色谱仪联结时, 阀件或管路一定要清洗干净;

  3)要注意流动相的脱气;

  4)避免使用高粘度的溶剂作为流动相;

  5)进样样品要提纯;

  6)严格控制进样量;

  7)每天分析工作结束后,要清洗进样阀中残留的样品;

  8)每天分析测定结束后,都要用适当的溶剂来清洗柱;

  9)若分析柱长期不使用,应用适当有机溶剂保存并封闭;

  5.检测器(UV)的保养:
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1)紫外灯的保养:在分析前、柱平衡得差不多时,打开检测器;在分析完成后,马上关闭检测器。

  2)样品池要保养。

  色谱柱

  液相色谱仪由高压液体泵、检测器及液相色谱柱等三部分组成,其中液相色谱柱的正确安装和使用,是液相色谱工作的关键;也是液相色谱工作者获得正确可靠的实验数据的必经之路。

  一、液相色谱柱的安装:

  1、液相色谱柱的结构:

  a、空柱由柱接头、柱管及滤片组装而成。

  柱接头采用低死体积结构,柱接头是两端螺纹组件,一端是为7/16英寸外螺纹,另一端是3/16英寸的内螺纹(国内外已规范化)。7/16英寸外螺纹与 1/4英寸柱管(Φ6.35mm)连接,中间放置压坏用于密封。3/16英寸的内螺纹与1/16英寸(Φ1.57mm)的连接管连接,中间也放置压环用于柱接头的密封。为了尽量减少柱外死体积,在安装色谱柱时,用Φ1.57mm连接管通过空心螺钉压环后要尽量插到底,然后再拧紧空心螺钉。压环被空心螺钉挤压变形后紧箍在连接管上(连接管通过压环后露出的管长度应严格控制在2.5mm长或其他固定尺寸)。

  在两端柱接头内,柱管两端各放置一片不锈钢滤片(或滤网),用于封堵柱填料不被流动相冲出柱外而流失。空柱各组件均为316#不锈钢材质,能耐受一般的溶剂作用。但由于含氯化物的溶剂对其有一定的腐蚀性,故使用时要注意,柱及连接管内不能长时间存留此类溶剂,以避免腐蚀。

  b、柱填料:

  液相色谱柱的分离作用是在填料与流动相之间进行的,柱子的分类是依据填料类型而定。

  正相柱:多以硅胶为柱填料。根据外型可分为无定型和球型两种,其颗粒直径在3—10 μm的范围内。另一类正相填料是硅胶表面键合—CN,-NH2等官能团即所谓的键合相硅胶。

  反相柱:主要是以硅胶为基质,在其表面键合十八烷基官能团(ODS)的非极性填料。也有无定型和球型之分。

  常用的其他的反相填料还有键合C8、C4、C2、苯基等,其颗粒粒径在3—10 μm之间。

  2,色谱柱的安装:

  a、拆开柱包装盒,确认色谱柱的类型、尺寸、出厂日期以及柱内贮存的溶剂。

  b、拧下柱两端接头的密封堵头放回包装盒供备用。

  c、 按柱管上标示的流动相流向,将色谱柱的入口端通过连接管与进样阀出口相连接(如条件允许,建议在柱前使用保护柱);柱的出口与检测器连接。连接管是外径为 1.57mm、内径为0.1-0.3mm的不锈钢管。连接管的两端均有空心螺钉及密封用压环。在接管时一定要设法降低柱外死体积。连接管通过空心螺钉、压环后尽量用力插到底,然后顺时针拧紧空心螺钉,直到拧不动为止,再用扳手继续顺时针拧1/4-1/2圈,切记不要用力过大。如色谱柱通过流动相加压后有漏液现象,请用扳手继续顺时针拧1/4圈,直至不漏液为止。

  二、液相色谱柱的使用:

  色谱柱在使用前,最好进行柱的性能测试,并将结果保存起来,作为今后评价柱性能变化的参考。但要注意:柱性能可能由于所使用的样品、流动相、柱温等条件的差异而有所不同;另外,在做柱性能测试时是按照色谱柱出厂报告中的条件进行(出厂测试所使用的条件是最佳条件),只有这样,测得的结果才有可比性。

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eesa_dc_seein[使用道具]
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好资料,很想全都看完!
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内容很全面,但是不够深入,希望LZ再接再励!
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谢谢分享
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好东西,谢谢楼主分享。
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回复 #2 LUMGR 的帖子

大家交流一下
很难在国内遇到同行
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乐乐常[使用道具]
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好贴,支持一下~~~~~
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谢谢分享!谢谢分享!
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没有泵压是怎么回事?

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