蛋白质与蛋白组学 » 讨论区 » 经验共享 » 【讨论帖】于蛋白电泳问题总结

采购询价

点击提交代表您同意 《用户服务协议》 《隐私政策》

 538  2/54 ‹‹12345678910›››|
 
需要登录并加入本群才可以回复和发新贴
打印 | 推荐 | 订阅 | 收藏

标题:【讨论帖】于蛋白电泳问题总结

fqswdzd[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 77226
精华 1
积分 295
帖子 285
信誉分 102
可用分 2181
专家分 10
阅读权限 255
注册 2011-11-15
状态 离线
11

发表于 2013-11-16 10:55 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


QUOTE:
原帖由 8princess8 于 2013-11-16 10:54 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
我觉得还是配胶时聚合的问题，我们组里现在那帮小朋友就时好时不好的，SDS的现象不知wangjun2002274 刻意注意过没有啊?

如果发现别的原因还望不吝赐教。 ...

我认为ＳＤＳ一次不要配得太多，反复在温水中溶解容易导致胶不聚合。碰到这种情况马上重配！
顶部
H2O[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 77273
精华 0
积分 434
帖子 547
信誉分 100
可用分 3566
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-11-15
状态 离线
12

发表于 2013-11-16 10:55 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我也遇到楼主的问题,不知道您是否已经解决.
更奇怪的是不仅marker小分子量的弥散,而且总蛋白电泳的时候蛋白条带也弥散.问了不少人现在总结一下:
1.最多的观点是样品的离子强度和胶存在差异,一般是样品的离子强度高了
可以通过透析来解决
2.上样缓冲液的问题,可以重配的,我换了一下没有什么改观
3.分离胶聚合的不好,有建议分离胶室温过夜的,还有4度过夜的,我试过了反正没有解决我的问题
4.pH值和所用水的问题
后来在我SDS-PAGE电泳的时候,我不上样,这样可以排除是不是样品的问题,我只加上样缓冲液,结果发现溴酚兰依然很弥散,因此我推测,不大可能是样品的问题.上样缓冲液我用别人正在正常使用的,还是不行,我想也不是上样缓冲液的问题,最后我推测问题还是出在胶上,但我试剂已经重新配制了一遍,结果没有改观,今天又重新配制试剂了,换了水.有了结果再和大家交流.
昨天重新配制tris－SDS8.8试剂后定pH,原来的问题已经解决啦
看来pH值对SDS电泳的影响很大。
顶部
fqswdzd[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 77226
精华 1
积分 295
帖子 285
信誉分 102
可用分 2181
专家分 10
阅读权限 255
注册 2011-11-15
状态 离线
13

发表于 2013-11-16 11:05 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
二、SDS-PAGE电泳中溴酚兰指示带弥散的问题

本人在用组织匀浆跑12%的SDS-PAGE电泳时，发现溴酚兰指示带不紧凑，在泳道的前沿好像有一些弥散的颗粒状东西，这样跑出来的电泳条带和western blot结果也不好看。
1. 不会是匀浆缓冲液的问题。我试过用PBS和Tis-HCl等缓冲液匀浆组织，然后上样。结果都是这样，电泳前沿的蓝色指示带弥散有一些小颗粒，随着电泳前移。 而我们用PBS配的蛋白质Marker却没有这种情况。
2. 不会是点样量的原因。经定过蛋白定量后上样（每道40ug），也没有改善。
3. 也不会是SDS-PAGE胶的原因。因为同一块胶上点的蛋白质Marker泳道很正常。
4. 样品在上样前经过离心，取上清点样。
5. 我用这种匀浆的样品做IP后，再用IP产物跑SDS-PAGE电泳，结果还是一样。
我觉得是样品出了什么问题，但不知如何解决。  
请哪位有过这方面实验经验的高手指点！
顶部
yonger[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 74174
精华 0
积分 572
帖子 803
信誉分 100
可用分 4861
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-10-7
状态 离线
14

发表于 2013-11-16 11:05 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
是由于你的裂解液中SDS未完全溶解，使蛋白变性不完全所致。回想一下，这种情况是不是只在气温低时出现？夏天时没有这种现象吧。裂解前，先将裂解液稍温，使SDS溶解即可。试试吧。记得告诉我你的试验结果。
顶部
fqswdzd[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 77226
精华 1
积分 295
帖子 285
信誉分 102
可用分 2181
专家分 10
阅读权限 255
注册 2011-11-15
状态 离线
15

发表于 2013-11-16 11:06 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

回复 #14 yonger 的帖子

你说的很对。这个问题我后来在样品中重新加入SDS Loading Buffer 后有了改善。现在想来，确实是因为变性不完全所致。
非常感谢你的提醒和帮助！
顶部
fqswdzd[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 77226
精华 1
积分 295
帖子 285
信誉分 102
可用分 2181
专家分 10
阅读权限 255
注册 2011-11-15
状态 离线
16

发表于 2013-11-16 11:06 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
三、电泳时蛋白条带弥散

不知为什么近几次跑电泳时，感觉浓缩胶没什么作用，样品依然很弥散，只是配的胶的浓度从8%提高到12%，各种溶液没有改变，，我用的上是20ul样品加20ul 2*加样缓冲液，混匀后煮沸5分钟，样品加样前12000转离心1分钟，现在我的电泳液只用一次，但问题依然没有解决。请各位帮忙。
顶部
caihong[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 73197
精华 1
积分 795
帖子 1206
信誉分 102
可用分 6856
专家分 10
阅读权限 255
注册 2011-9-20
状态 离线
17

发表于 2013-11-16 11:07 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

你可以重新配过胶试试，看是否是胶的问题。
另外，加样一定要加到孔低，否则也会出现这种情况，我就有好几次是这样。
还有，浓缩胶一定要有一定的宽度。
我想问你，你每孔的蛋白上样量是多少？
顶部
fqswdzd[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 77226
精华 1
积分 295
帖子 285
信誉分 102
可用分 2181
专家分 10
阅读权限 255
注册 2011-11-15
状态 离线
18

发表于 2013-11-16 11:07 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我加样时都加到孔底的，加样量是10ul样品加10ul上样缓冲液。
我陪胶的液体都是原来的，就算是失效都不应该发生在一夜之间吧，只有我的30%的丙烯酰胺是新配的，我问了一下别人，怀疑是它没过滤的事。
顶部
ritou1985[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 77664
精华 0
积分 644
帖子 948
信誉分 100
可用分 5596
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-11-19
状态 离线
19

发表于 2013-11-16 11:07 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

如果经常电泳，凝胶一般不会突然出现问题。
是不是蛋白不溶解，上样时好好离心一下。
或者样品中盐浓度太高了。
顶部
cwcwcww[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 101434
精华 1
积分 311
帖子 277
信誉分 102
可用分 2191
专家分 10
阅读权限 255
注册 2012-12-3
状态 离线
20

发表于 2013-11-16 11:08 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

你肯定是蛋白弥散吗？
是否是上样量不够？你每孔的蛋白总量是多少ug？
顶部
 538  2/54 ‹‹12345678910›››|