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标题:【讨论帖】于蛋白电泳问题总结

fqswdzd[使用道具]
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发表于 2013-11-16 11:12 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
四、蛋白质电泳的问题

大家好，我最近在做蛋白质的活性电泳，但是蛋白质老跑不到分离胶中，我的分离胶浓度为6%，最初用的浓缩胶浓度为5%，后来看到有些战友认为把浓缩胶浓度改为3%就可以跑出条带，但我今天试了一下也没有见到条带，我真不知道是什么原因，蛋白质浓度应该没有问题，因为前两天我在上样BUFFER 中加了一点点SDS即可看到明显的蛋白质条带，请大家多多指教，看问题出在哪？
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fei1226com[使用道具]
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发表于 2013-11-16 11:13 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
因为前两天我在上样BUFFER 中加了一点点SDS即可看到明显的蛋白质条带，

什么意思啊？困惑！你说跑不到分离胶中，那么就是说在浓缩胶中罗？！还是浓缩胶中也没有？如果两者中都没有，可能是你后来的染色、脱色有问题，而如果是前者的话，我觉得不可思议啊！你的蛋白质分子量多少？！
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fqswdzd[使用道具]
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发表于 2013-11-16 11:13 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

回复 #32 fei1226com 的帖子

“我在上样BUFFER 中加了一点点SDS即可看到明显的蛋白质条带”，是指我最初做活性电泳的时候，由于不小心用了含SDS的Tris buffer配制上样buffer。
非常感谢fei1225com，我这两天发现，可能是蛋白质的PI与浓缩胶的PH接近，所以蛋白质跑不出来，我今天直接用连续电泳，染色以后有条带出现，这也可以作为后来者的借鉴！
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fei1226com[使用道具]
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发表于 2013-11-16 11:14 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
好啊，对我也有启示，你可以预测PI的啊，试试看是不是真的接近，然后麻烦反馈一下结果，谢谢！
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fqswdzd[使用道具]
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 小中大

回复 #34 fei1226com 的帖子

Sorry,由于我们实验室目前还不能做IEF，而且我正在纯化它，还没有它的全序列，不然可以用DNAman等相关软件预测PI，所以只有等以后结果出来在通知你，好吗？
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发表于 2013-11-16 11:14 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
可以放在冰箱中进行，有可能是电泳过程中蛋白质失活了
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fei1226com[使用道具]
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发表于 2013-11-16 11:15 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
你如果知道DNA序列或者氨基酸序列就可以直接上网预测它们的PI啦！
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fei1226com[使用道具]
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发表于 2013-11-16 11:15 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


QUOTE:
原帖由 is2011 于 2013-11-16 11:14 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
可以放在冰箱中进行，有可能是电泳过程中蛋白质失活了

一般SDS-PAGE电泳都会置于液体冷凝系统中进行的啊，这个我想应该不会成为问题吧？！
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vivian4123[使用道具]
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发表于 2013-11-16 11:15 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

按你说的情况，最主要的问题可能是你的配制凝胶时间没有加入SDS，这样的话，由于我们的电泳是SDS系统电泳，必需有SDS与蛋白质结合，蛋白质才能在凝胶中移动，所以我们的凝胶和电泳buffer、样品buffer均应含有SDS，要不然，SDS电泳就不叫SDS电泳系统了。
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fqswdzd[使用道具]
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发表于 2013-11-16 11:16 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
要说明一下，蛋白质的活性电泳是不能加包括SDS在内的任何变性剂的，不然蛋白质就会失去活性！
欢迎大家继续对本问题的讨论，有什么好的经验大家可以共享！
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