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标题:【讨论帖】于蛋白电泳问题总结

fqswdzd[使用道具]
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发表于 2013-11-16 11:17 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
五、SDS-PAGE怎么跑不出带？

我跑了两次SDS-PAGE，但都没有跑出带，连MARKER都没有，如果是我的目的蛋白有问题，应该有MARKER的。我怀疑是降解了，是不是考马斯亮蓝用久了就会有蛋白酶？
请帮帮我，谢谢！
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tuuu2[使用道具]
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发表于 2013-11-16 11:17 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

建议可以整块胶一起考染，不要把浓缩胶剥下来，看看蛋白是不是在浓缩胶上。
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glass[使用道具]
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发表于 2013-11-16 11:17 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

呵呵
我认为你连MARKER 都没有跑出来，不应当首先考虑蛋白降解问题，再说电泳时的蛋白是变性的。。。我想你应当考虑：1）你的电泳系统是否有问题，比如缓冲液、电泳的条件等。2）样品处理和MARKER本身是否有问题。3）染色液和脱色液的问题。建议你用别人跑过的样品做一个阳性对照
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eric930[使用道具]
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发表于 2013-11-16 11:18 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

建议：
1.用新的marker。
2.染色液和脱色液的问题，我认为这种情况较少，没有染上或脱色过度，重新配制染色液和脱色液。
3.样品是如何处理的，重新处理样品。
4.电泳问题或胶的问题，根据你目的蛋白的分子量选择合适的胶。电泳的时候你看到染色剂跑下来了吗？
总之，不论哪一个环节出错了都可能出现这种情况，所以你要一一排除！
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fqswdzd[使用道具]
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发表于 2013-11-16 11:18 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我用的是新的HMW，染色液和脱色液也是新配的，根本没用上脱色液，染完一看就没上色，样品的处理也是按照规定程序进行，电泳时能够很清楚看到染色剂跑下来，而且跑得很好。
但是电压是140V时，电流还是13A，是不是电流太小啊。但如果是电流问题，为什么染色剂跑得那么漂亮？
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dongdongqiang[使用道具]
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发表于 2013-11-16 11:18 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
可能是染色液太久了，浓度低了，换银染试试。
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tangxin_80[使用道具]
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发表于 2013-11-16 11:19 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

依我之见还是完成一下脱色，有时候光靠染色并不能直接判断电泳的结果。

尤其是当上样量很小或者染色液过浓的情况下。
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tangxin_80[使用道具]
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发表于 2013-11-16 11:19 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

染色都没有条带，脱色后也不会有的，可能是你的染色液和上样缓冲液的问题，你要确性其中的成分没有错。如果样品中有蛋白，应该能染出来，用银染要敏感一些。
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发表于 2013-11-16 11:20 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

能否说一下你的详细步骤，包括你的胶浓度。
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fqswdzd[使用道具]
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发表于 2013-11-16 11:21 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我把上样缓冲液重新配一下看看，步骤应该是一样的，灌好胶后，用2倍样品缓冲液10ml混合样品10ml，沸水煮5分钟。marker是HMW，配置前是蓝色粉剂，用100微升融解，我取了5微升，我不知道生产商的marker是用什么染色的，可能是二甲苯青，一起煮，接着上样。我用的是12％的分离胶和3％的浓缩胶。我刚有用6％的分离胶与10％的浓缩胶跑了，还没跑完，待会看看。
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