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标题:【讨论帖】于蛋白电泳问题总结

fqswdzd[使用道具]
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八、想从sds胶里面回收蛋白,几个相关的问题

想从sds胶里面回收目的蛋白,用来免疫。看原来有大侠说过切下胶条装入透析袋中,水平电泳,然后浓缩。
请问1、水平电泳用的缓冲液是不是也是tris-gly,透析袋中一般加入多少缓冲液,是不是越少约好(估计蛋白50-100ug的样子)。
2、考马湿亮兰怎么除去,(用不用除去,如果用于免疫的话)
3、最后得到的浓缩蛋白是还用电泳缓冲液溶着?
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49888[使用道具]
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我看过他们的贴子,你可能没有理解透彻:
1、电泳用的缓冲液可以是你即将要用的缓冲液,或者是使你的蛋白质稳定的缓冲液,缓冲液的量应该是使得胶完全被浸盖,不宜太多。
2、染色的只是你胶的一个很小的部分(一个电泳条带),目的是为了指导你切取其他电泳带的相应目的条带位置,而不是全部染色。
3、我觉得最后的保存缓冲液可以根据你的需要更换,也可以冻干等等,即可以按照蛋白纯化产品同样的方法处理。
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ritou1985[使用道具]
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我的一点经验:
1、电泳的凝胶用250mM的KCL染色,只需要几分钟就可以使蛋白条带呈现乳白色,根据位置切下需要的条带即可,脱色可以用ddH2O,可以不脱。非常方便快捷,无染料污染问题。
2、水平电泳回收后一定要取回收的样品再电泳看看回收效果。因为水平电泳回收过程中会产热造成蛋白降解,这方面我有惨痛的教训啊,让我浪费了大量的时间及金钱!
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guagua[使用道具]
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一个弱的问题:
从SDS胶中切下的条带中回收的目的蛋白目的蛋白纯吗
理论上说一个条带中应该含有很多种蛋白才是啊

我现在实验中的一个难题是如何从SDS胶上选取含目的蛋白的条带,又能否确保这个条带中蛋白质复合物较少。
WB?或其他方法?
谢谢
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tie8[使用道具]
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理论上确实相同分子量的蛋白都会处于同一条带中,所以需要证明其纯度。就我们实验来说,在原核系统中表达蛋白做抗体,诱导与未诱导电泳对照,目的蛋白条带只在诱导的全菌体中出现,而在未诱导中没有,再经wb确证,说明该条带只对应的目的蛋白。然后将蛋白初步纯化,使电泳时目的蛋白附近没有其他杂蛋白条带,这样切胶回收的蛋白纯度就比较高了。
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QUOTE:
原帖由 tie8 于 2013-11-16 14:27 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
理论上确实相同分子量的蛋白都会处于同一条带中,所以需要证明其纯度。就我们实验来说,在原核系统中表达蛋白做抗体,诱导与未诱导电泳对照,目的蛋白条带只在诱导的全菌体中出现,而在未诱导中没有,再经wb确证,说明该条带只对应 ...

你的方法很妙,在做有差异的蛋白方面见长
我的问题是没有对照的,而是寻找标志性蛋白,不知道还有别的方法没
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yhz1973[使用道具]
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相关疾病:
头痛水疱

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我看过他们的贴子,你可能没有理解透彻:
1、电泳用的缓冲液可以是你即将要用的缓冲液,或者是使你的蛋白质稳定的缓冲液,缓冲液的量应该是使得胶完全被浸盖,不宜太多。
2、染色的只是你胶的一个很小的部分(一个电泳条带),目的是为了指导你切取其他电泳带的相应目的条带位置,而不是全部染色。
3、我觉得最后的保存缓冲液可以根据你的需要更换,也可以冻干等等,即可以按照蛋白纯化产品同样的方法处理。

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1.电泳用的缓冲液就是电泳缓冲液。
2.部分切胶染色,头疼的问题是染色和脱色时胶会缩小,这样就不容易对齐,容易切错位置,如果分离胶短,就更容易切错!当然可以用水泡使其涨大,注意要及时终止。我现在用的一种方法是,整块胶染色切下目的条带,洗脱后将染色的目的蛋白洗脱液再次直接上样电泳,之后部分切胶染色(步骤同第一次),染色后对齐切胶,因这次蛋白较纯,可以切宽一点, 即使稍不对齐, 也不影响蛋白纯度。第二次电泳后考马斯亮蓝染料就和蛋白分离了。
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fqswdzd[使用道具]
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九、SDS-PAGE电泳后可以回收再复性吗?

我的蛋白在E.COLLI里未融合表达,25度下为全部可溶状态
NATIVE-PAGE跑的不好,有很多差异,不知道哪个是我的蛋白
但是我的SDS-PAGE跑的很好,知道我的目的蛋白在哪里,能不能SDS-PAGE电泳后可以回收再复性?
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u234[使用道具]
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你可以试试吧,好象没有听说这么做的.估计是悬.
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IAM007[使用道具]
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相关疾病:
电击伤
我认为可以试一下,郭尧君编著的----蛋白质电泳实验技术----上是这样写的:在常规PAGE电泳以后,在凝胶中或洗脱后可以检测天然蛋白质的生物活性。SDS电泳后也有这种可能性。从蛋白质中除去所有的SDS,许多蛋白质会恢复活性,或至少恢复部分活性。因为SDS不一定导致不可逆变性,但有许多因子影响活性的恢复。
1)SDS的纯度:市售的SDS常含有DDA等杂质,它们与蛋白质的结合比SDS紧,因而影响蛋白质活性的恢复;
2)蛋白酶的影响:在样品的准备过程中,蛋白酶降解蛋白质,因而影响蛋白质活性的恢复;
3)二硫键对活性没有贡献的蛋白质和非均一亚基组成的蛋白质,最容易被恢复活性;
4)尽可能慢地排除所有结合和非结合的SDS,使变性蛋白质有足够的时间去恢复天然的构象而复性,所需的时间取决于蛋白质的结构;
5)在恢复活性所用的缓冲液中应该包括在电泳过程中被迁移出的辅助因子和辅酶。高浓度底物、氯化钠、甘油和硫还原试剂如DTT的存在也将对酶的活性恢复有利;
6)疏水蛋白质恢复活性时,必须用无离子去污剂或两性离子去污剂替代SDS,以保持蛋白质的可溶性。
希望以上的资料能对你有用!
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