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标题:【求助】居然不表达，怎么办？

wanglaoshi[使用道具]
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发表于 2013-11-17 15:59 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我个人觉得你的蛋白质可能比较的大,表达量可能很小,可能用SDS-PAGE 看不出来,不知道能否提供一些有关蛋白质的信息,让大家分析分析
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ha111[使用道具]
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发表于 2013-11-17 16:00 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
不知道你怎么是判定不表达的，是通过SDS－PAGE确定的吗？如果你的蛋白表达量很低，也许仅通过电泳判定不表达是不够的。建议你最好再做下WB，要是手头没有合适的抗体，或者也可以考虑上一下His柱子看看，也许会有新的信息让你取得。
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TAT[使用道具]
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发表于 2013-11-17 16:00 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

哈哈，今天我用PMAL－P2x（NEB公司的）融合表达2个蛋白全部可溶（25oC IPTG0.1mM），用PET28a就是不表达，估计是有毒！，换成融合表达效果很好！
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yes4[使用道具]
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发表于 2013-11-17 16:01 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我用的是和搂主一样的 载体和宿主菌，用WB斑点杂交检测是阳性，可是跑PAGE胶却一直看不到带，请问我 下一步该怎么做啊 ？麻烦高手指点。
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龟仙人[使用道具]
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发表于 2013-11-17 16:01 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
也不排除表达蛋白有毒性，但一般情况下是以包涵体存在的，应该不是。
这样吧，两个试管培养5ml，Amp加至终浓度200，过夜，一管抽提载体验证，一管离心，去上清，将菌体接入100ml新的抗性培养基，4－6hr,加IPTG至0。1，诱导8个小时。

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做过了，不行啊。
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xue258[使用道具]
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发表于 2013-11-17 16:02 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

根据它的说明书，你切了NDEI位点之后，它的第一个aa是有要求的，具体的我记不清楚了；如果没有满足的话产生的蛋白质会被细菌溶解；不知道现在问题解决了没有；

最近我也在纠结这个问题；
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