小中大你好﹗ 最近實在是忙。現就結晶時蛋白buffer問題做簡單的回復。你還得自己看文獻進一步了解。
現在通用的是以篩選方式來確定結晶篩選時蛋白溶液所用buffer.
1. 以動態光散射(Dynamic Light Scattering, DLS)來測蛋白粒子的表觀分子量與分散度。分散度的情況可以確定蛋白分子是否均一。通過篩選﹐此法可以確定蛋白在哪種buffer中穩定均一。這裡有幾個網頁﹐可以作為參考文獻來讀。
激光動態光散射儀操作手冊
cuturl('http://biotech.ustc.edu.cn/html/jishuluntan/2006/0727/12.html')
可以了解一下原理。
JBS solubility Kit cuturl('http://www.diffractia.com/upload/CO-310.pdf')
(如果有DLS這種條件﹐可以自己配制)
2. 熱螢光分析
主要原理就是在加熱狀態下測定蛋白的穩定性來篩選合適的buffer。螢光燃料Sypro Orange在水溶液中幾乎不發螢光﹐但與蛋白中低介電常數的憎水基團部位結合後會發出高螢光。在一定的buffer體系下﹐加熱時﹐沒有達到一定溫度時﹐反應體系沒螢光﹔但當達到一定的溫度時﹐蛋白會變性unfolding﹐憎水基團暴露﹐結合Sypro Orange﹐即發出螢光。發螢光所需的溫度越高﹐蛋白在這個體系中越穩定﹐其抗外力能力越強﹐表明蛋白越穩定。這樣結晶的幾率高。除了buffer外﹐還可用來篩選添加劑﹐重原子等。也可應用于NMR蛋白buffer篩選。這裡要用到Real Time PCR儀器。
文獻: cuturl('http://www.sciencedirect.com/science?_ob=MImg&_imagekey=B6W9V-4KM3WDT-4-C&_cdi=6692&_user=16764&_orig=search&_coverDate=10%2F15%2F2006&_sk=996429997&view=c&wchp=dGLbVtb-zSkzS&md5=1074015c0d601d75671ef443b2d54f3d&ie=/sdarticle.pdf')
Thermofluor-based high-throughput stability optimization of proteins for
structural studies. 裡面有詳細的原理與實驗數據分析。
3. 如果沒有相應的條件﹐可以使用第三個簡單的方法。用提取蛋白是所用的buffer﹐如Tris, HEPES等﹐來做首次晶體篩選。如果有晶體﹐很好。若果沒有﹐則挑選那些澄清懸滴所用的buffer來作為下一次篩選的蛋白buffer﹐再次篩選。可能有好運。
(要是文獻下載有問題﹐請指出)
