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标题:【求助】】Western blot省钱大攻略

abc816[使用道具]
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1. 建议转完膜后一定要丽春红染色看看,一来可以基本判断蛋白的降解情况,二来看看转膜是否成功,丽春红染不出的话,及时找原因重新做,也算是省钱省时间的一种方法。昨天实验室丽春红没有了,转膜之后很不放心,不知转成了没有,待会显影看看......

2.关于一抗孵育,我们一直用封口机做小袋子,一两毫升抗体可以充分孵育很大的一块膜,孵完还可以回收抗体。

3. 加样时多加两孔阳性样品,转膜后剪成小条,做单一抗,但二抗的对照,可以排除一些背景产生的原因。
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abc816[使用道具]
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呵呵,希望大家响应啊,毕竟不是每个实验室都很富有的,希望集思广益,不断改进WB,最后整理出dxy特有的WB省钱省时超值protocol~~~

还有预染marker问题:
预染marker一般都很贵,尤其是伯乐等公司的,所以购买任何一家公司的预染marker都要在建议的上样量之后进行梯度稀释,如:建议5ul/lane,可以用3ul/lane,2ul/lane,1ul/lane,这样做一次预实验,一般是稀释一倍还可以用的。

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Marker我个人认为Fermentas的pageruler性价比还是不错的,而且还是双色预染,我一般用2ul,转膜后效果和我刚刚上面的那个图差不多。1ul转膜后效果不是太好。
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我们一抗二抗稀释都是用10cm*7-8cm大的小塑料盒,一抗一直在里面放这就行,用完就放4度,最少都能用两次,国外的还可以用3、4次。用奶粉溶于TBST稀释抗体的,不过最近听说用鱼皮稀释的抗体能用4-5年呢,请问那位有用过的吗,介绍以下,谢谢
还有卖抗体的时候多跟他们要赠品,说不定还能赠个小包装的,或二抗什么的呢,能要多少算多少
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楼上说的SDS析出问题我没发现,我就是这样配的,也是4度存放的
还有配好的胶过夜肯定不好,水分蒸发了胶干了跑当然不好,我说的是分离胶配好加水封存凝固后可以放4度
另:

我再补充点;j蛋白变性的时候可以使用PCR仪,设一个98度的PROTOCAL,这样煮沸的时候存在的爆管以及进水的问题都解决了,很佩服这个主意,因为那2个问题我都遇见过,很郁闷的。。
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个人认为一抗还是不回收的好,我们实验室一直是用封口机将EP手套按膜的大小做成小袋子,只用1、2ml就足够了。每次santa的抗体1:1000~1:2000,也不算浪费。
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做了好多的WB,说一下自己的体会,和大家交流:
1.抗体我也认为没有必要回收。买一次抗体,对整个试验来说绝对的绰绰有余,包括中间还可用来做免疫荧光试验;如果回收后效果不好了,那就相当于你浪费了好多的前边的材料,更重要的是,浪费了时间,大家大部分都是上学期间做试验,几年就要毕业,什么最不能浪费? 我认为是时间。试验可以再做,但日子确一天一天越来越少,不值。。。
2。每次跑WB,加预染marker,这样剪目的条带可有的放矢,尽量剪小却不会丢掉目的蛋白,这样后边的PVDF膜,转膜时的滤纸,后边孵育的抗体都能相应节约;
3。膜发光后,用stripping buffer洗脱后,加入新的抗体,可反复利用,节约时间和蛋白样本及其PVDF膜等等。
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vcve[使用道具]
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非常好的话题,其实前面我也有讨论过这个话题,比如抗体如何回收,或者用较好的发光试剂盒节约抗体等等。今天我来说一个最近才用的方法,感觉挺好的:
购买的NUNC公司的这种方形细胞培养板,其实不贵,但是我建议最好几个实验室一起买,我买的100个/800RMB,直接美国空运过来的(国内代理)。

每次一个孔中加入1-2ml抗体稀释液即可充分浸润PVDF膜。自我感觉非常方便,可以反复使用。而且对于比较窄的膜,完全可以每个孔中放2-3条PVDF膜。我们都是按照marker剪开不同的抗体孵的。算下来真是太便宜了。效果不错,但是注意最好是买未处理表面的那一种。

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用封口膜自己做相应大小的盒子也不错的。
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abc816[使用道具]
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做了几次western blot,和各位大家比,估计还是新手,说说自己的"节省"
1 节约时间,首次做的时候最好用“最浪费”的条件做,比如一抗二抗的稀释倍数了,试验所使用的耗材和试剂了,只要能做出来,再“浪费”也值得,如果第一次做不出来不经试剂耗材浪费了,时间也浪费了,更重要的是信心受到打击。
2 在试验成功的前提下,考虑试剂耗材的节省,我们孵一抗二抗发光液都是用封口膜自制膜盒,这样很节省抗体且接触良好。在使用PVDF膜时,我一般先用尺子把胶,滤纸的的尺度量好,然后剪膜,很合适且转膜的时候基本不用考虑短路问题很省时间(第一次做转膜花了90MIN)。
3 如果短期(一周)使用,定影液也可以回收的,个人感觉显影液回收效果不好。
4 在同样样品不同目的蛋白时,可以以MARKER为标准,转膜后剪开,分别孵育不同抗体。
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DNA[使用道具]
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刚刚写了好多话,本来想弄张图片上来的,没发现不能超过300kb,结果写的内容全部没有了。只好言简意赅的重新写点了。
简单说来有以下几点:
1:所有的液体都可以配成10*的贮存液,这样比较方便,也减小误差
2:runningbuffer 外槽中的液体是可以重复利用的,至少五次
3:跑胶完毕,先裁胶,在转膜,因为PVDF膜很贵,这样比较划算
4:一抗可以用5ml的EP管回收,以便重复利用
5:发光液的使用,先把目的条带裁下来,然后将发光液200UI直接打到PVDF膜上,然 后压片,曝光。因为发光液也很贵。
其实这里面最贵的也就是一抗,二抗,PVDF膜,发光液,这几个环节做好了,就可以花最少的钱,做最好的WB了。
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remenb[使用道具]
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说说我的体会:
1 湿转的转膜液可以重复用几次,用后放在四度.如果恒压转发现电流比上次小,可以在里面补充甲醇(挥发过多)
2 转膜用的滤纸可以重复用
3 marker可以用2-3ul,完全够用
4 跑完胶。根据预染marker就能估计目的条带的位置,所以可以剪下合适大小的膜。
5 封闭液我们买脱脂奶粉,用PBS配,效果还可以
6 不要吝啬的是洗脱液,每次洗脱多放一些,洗涤时间每次也不少于5分钟,保持背景 干净;
7 杂交时,用压膜机做杂交的口袋,杂交液基本都是2-5毫升就够了,按照1:500稀释,抗体也不过用两三微升,如果不是抗体不够用救急,一般不回收重复用。
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