小中大5. 膜漂在水面(或者甲醇液面)让液体从下通过膜上的孔渗上来以赶走膜内空气,膜彻底浸润后颜色会变深一点,任何白点或者斑都是没有完全浸润的标志,会影响转膜的。最后浸没入缓冲液里平衡。甲醇处理PVDF不要超过15秒。以后的步骤中不要让膜干涸了。
6. 电转移缓冲液通常用Tris glycine系统,如果是转膜后有部分样品要蛋白测序,最好用CAPS缓冲液,减少甘氨酸对测序的污染。
7. 半干电转移(Semi-Dry)用经过缓冲液饱和的滤纸代替传统转移槽,非常节约试剂,而且效果也好。由于不用“泡”在缓冲液中,半干转不单可用均一缓冲体系,也可以做非均一转移缓冲体系。半干转可以在30分钟内完成转膜(每平方厘米电流2.5—3.5mA,恒流,冷库。如果电流要求小可以延长到 60—90分钟,但要防止过热。如果有那种温度贴,可以贴上参考温度),即使205KD这么大的蛋白转膜效率也高达80%。各种大小的蛋白的转移效率都 OK。半干转可以上下层叠2块胶+膜一起转(面积还是按照单个计算),只要控制好单位面积的电流强度,防止过热就好了。
8. 有人觉得转膜加SDS有助于大分子蛋白转膜,我个人持保留意见,因为SDS等去垢剂影响硝纤膜和蛋白的结合,反而不好。
9. 如果只做Western Blot,膜可以用丽春红S染色并在脱色前照相,对后面的免疫反应影响不大。不要用考马斯亮蓝或者氨基黑染色膜以免影响结果。如果有预染Marker需要用针或者笔扎眼记录条带位置,以免后面会洗掉而无法判断结果。预染Marker也有助于判断转膜的效率和情况,如果比目标分子大的Marker都已经转过去了,那就OK了。
10. 有人说在中性条件下电泳有助于蛋白测序,如果要蛋白测序需要提前一天倒胶,并说预电泳6小时(有还原剂如Glycolate)后再倒积层胶。除了要做HPLC分析应该用丽春红S而不要用考马斯亮蓝或者氨基黑染色,其他的比如测序或者PTH都可以选灵敏度高些的考马斯亮蓝或者氨基黑。
11. 转印后的PVDF膜在含20%甲醇溶液中在白透射光照下不用染色也依稀可以看到透明的蛋白条带,有时这种快速的方法可以不用染色识别条带,避免染色膜影响后继实验。
转膜后的封闭注意:
12. 转膜后,膜上其他的空白位置需要用封闭液封闭。Western的灵敏度某种程度上受限于封闭做的好不好。脱脂奶是最常用的经济配方,用这种封闭剂由于里面可能有痕量的生物素和碱性磷酸酶,可能造成背景污染而不适合生物素—亲和素的检测方法,脱脂奶也不适合碱性磷酸酶检测(AP)方法。如果采用碱性磷酸酶检测系统,封闭剂最好用6%酪蛋白+1%聚乙烯吡咯烷酮+10mmol/L EDTA磷酸缓冲盐加热65度1小时确保碱性磷酸酶失活(可以加0.05%叠氮化钠,新鲜最好)。经济的脱脂奶配方和AP兼容得不太好,再加上HRP的底物选择范围也更宽,现在HRP是越来越普遍的选择。但是叠氮钠(NaN3)对辣根过氮化物酶(HRP)有灭活作用,如果用HRP检测系统则封闭液不要加叠氮化钠为好。切记:封闭时间和封闭剂的量都要足够。
13. 如果选用AP作为显色方法,封闭时就要选择Tris缓冲体系,不要用PBS,因为PBS干扰AP。
这些小孔的孔径随 “双丙烯酰胺~丙烯酰胺” 比率的增加而变小,比率接近 1:20 时孔径达到最小值。SDS聚丙烯酰胺凝胶大多按“双丙烯酰胺~丙烯酰胺”为1:29 配制,试验表明它能分离大小相差只有3% 的蛋白质。
分离胶及浓缩胶均可事先配好(除AP及TEMED外),过滤后作为储存液避光存放于4℃,可至少存放1个月,临用前取出室温平衡(否则凝胶过程产生的热量会使低温时溶解于储存液中的气体析出而导致气泡,有条件者可真空抽吸3分钟),加入10%AP(0.7~0.8:100, 分离胶浓度越高AP浓度越低,15%的分离胶可用到0.5:100)及TEMED(分离胶用0.4:1000, 15%的可用到0.3:1000,浓缩胶用0.8:1000)
胶浓度<10%时可用0.1%的SDS封,浓度>10%时用水饱和的异丁醇或异戊醇,也可以用0.1%的SDS),封胶后切记,勿动。如用醇封胶需用大量清水及ddH2O冲洗干净,然后加少量0.1%的SDS,目的是通过降低张力清除残留水滴。
两胶板之间的电泳液要满. 接好正负极, 开始电泳, 可先小电压,约50V ,大约跑过浓缩胶后再改为100V. 观察MARKER的情况, 适时终止电泳.
建议说目的带要跑到分离胶的2/3处比较好,但本人一直都在上1/3处,结果也还可以.如果浓缩胶跑的好的话, 几个孔的蛋白会跑成一条直线.
注意加样时间要尽量短,以免样品扩散,为避免边缘效应,可在未加样的孔中加入等量的样品缓冲液
未聚合的丙烯酰胺具有神经毒性,操作时应该戴手套防护.梳子插入浓缩胶时,应确保没有气泡,可将梳子稍微倾斜插入以减少气泡的产生,梳子拔出来时应该小心,不要破坏加样孔,如有加样孔上的凝胶歪斜可用枕头插入加样孔中纠正但要避免针头刺入胶内.
10* 电泳缓冲液: Tris7.58克, 甘氨酸36克, SDS 2.5克, ddH2O定容到250ML.
不好溶,可用搅拌器.
可重复使用,每次加一些新的进去.但本人每次都是配新的,也不麻烦.
转膜:
跑完电泳后,取出胶,可以一块做考马思亮蓝R250染色约30分钟, 脱色液脱色, 看看蛋白条带跑的如何,上样量如何.
另一块可用做转膜. 放入转移缓冲液中摇30分钟左右(有次着急只晃了10分钟,结果也挺好的)。NC膜,0.22um ,效果挺好的,MARKER易染上,丽春红也易着色,还一洗就掉。能比较清楚的了解转膜效果。
不同转膜仪和电源转膜的条件不同,我用的是BIO-RAD 的半干转(电压不过25V的那款),电源是BIO-RAD的PC200,70KD的我转50分钟,20V,17KD的转20V,30分钟左右,条件不是很稳定,有时半路打开盖子看看MARKER转的情况,但膜和胶的位置一定不能窜。也有人说用恒流,说1.2-2MA/CM2我看了一下,我的胶大约都是 5*3左右大的,20V一般电流会是60-30MA之间,要是这样算的话,最高就30MA, 我不太清楚.