原子荧光

　荧光分光光度计是用于扫描液相荧光标记物所发出的荧光光谱的一种仪器。其能提供包括激发光谱、发射光谱以及荧光强度、量子产率、荧光寿命、荧光偏振等许多物理参数,从各个角度反映了分子的成键和结构情况。通过对这些参数的测定,不但可以做一般的定量分析,而且还可以推断分子在各种环境下的构象变化, 从而阐明分子结构与功能之间的关系。荧光分光光度计的激发波长扫描范围一般是190~650nm，发射波长扫描范围是200~800nm。可用于液体、固体样品(如凝胶条)的光谱扫描。

　　荧光光谱法具有灵敏度高、选择性强、用样量少、方法简便、工作曲线线形范围宽等优点，可以广泛应用于生命科学、医学、药学和药理学、有机和无机化学等领域。

　　一.基本结构与原理

　　由高压汞灯或氙灯发出的紫外光和蓝紫光经滤光片照射到样品池中，激发样品中的荧光物质发出荧光，荧光经过滤过和反射后，被光电倍增管所接受，然后以图或数字的形式显示出来。

　　基本结构和原理如图所示，光源与检测器成直角方式安排。

　　荧光分光光度计基本结构和原理图

　　1. 光源：

　　为高压汞蒸气灯或氙弧灯，后者能发射出强度较大的连续光谱，且在300nm～400nm 范围内强度几乎相等，故较常用。

　　2.激发单色器：

　　置于光源和样品室之间的为激发单色器或第一单色器，筛选出特定的激发光谱。

　　3.发射单色器：

　　置于样品室和检测器之间的为发射单色器或第二单色器，常采用光栅为单色器。筛选出特定的发射光谱。

　　4. 样品室：

　　通常由石英池(液体样品用)或固体样品架(粉末或片状样品)组成。测量液体时，光源与检测器成直角安排;测量固体时，光源与检测器成锐角安排。

　　5. 检测器：

　　一般用光电管或光电倍增管作检测器。可将光信号放大并转为电信号。

　　二.AMINCO-Bowman扫描荧光分光光度计

　　AmincoBowmanSeries2型荧光分光光度计是美国Thermo司产品，是目前最新的扫描荧光分光光度计，具有独特的双光源设计。

　　

　　Aminco Bowman Series2型荧光分光光度计

　　(一)结构特点

　　1.氙灯、闪光灯

　　150W连续照明灯的光照强度足以进行灵敏度很高的荧光测量;闪光灯既可用于荧光测量，又可用于磷光测量。可根据自己的分析要求选择一种或两种光源。

　　2.单色器

　　均为Seya-Namioka设计，采用凹面全息光栅和为数极少的反射镜。既简单又耐用，不需要现场校准。计算机驱动光栅，控制狭缝，既准确 (+/-0.1nm)、又快(12000nm/min)，可靠性还高。

　　3.光电倍增管检测器

　　光电倍增管(PMT)有两种工作模式：a.模拟――高灵敏度，宽动态范围，操作方便;b.光子计数――提供极高的灵敏度,联结式盖锁可保护PMT。

　　4.附件

　　T-Optics多功能样品室可配多种附件，完成多种应用。

　　(二)功能特点

　　1.荧光发射光谱

　　选择某一固定波长的光激发样品，记录样品中产生的荧光发射强度与发射波长间的函数关系，即得荧光发射光谱。

　　2.荧光激发光谱

　　选定某一荧光发射波长记录荧光发射强度作为激发光波长的函数，即得荧光激发光谱。

　　3.时间分辨技术;

　　可用于对混合物中光谱重叠但有寿命差异的组分进行分辨并分别测量。

　　时间分辨荧光测定公式如下：

　　P(t)=P0EXP(-t/τ)

　　式中P(t)：拟合指数函数

　　P0：强度取值

　　EXP：指数运算符

　　t：时间取值

　　τ：荧光平均时间寿命

　　时间荧光光谱如图所示。其中A组分受激发而产生的荧光寿命短于B组分，因此可以对混合物中的A组分和B组分同时进行分辨和测量。

　　

　　时间荧光光谱

　　4.偏振和各向异性技术;

　　荧光偏振和各向异性的测量揭示了荧光体吸收光子和随后发射光子的平均角移。偏振度与荧光体转动速度成反比，可用于测定抗体和抗原的含量。

　　5.同步扫描技术;

　　同步荧光技术是在同时扫描激发和发射波长的情况下来测绘荧光光谱图。由测得的荧光强度信号对发射或激发波长作图,即为同步荧光光谱。它包括固定波长的同步荧光和固定能量的同步荧光两种光谱。

　　(1)固定波长的同步荧光光谱

　　在同步扫描中,使激发波长和发射波长保持固定的波长间距,即在Δλ=λem-λex=常数的情况下进行扫描,以同步荧光信号(相对强度)对发射或激发波长测绘荧光光谱图,则为固定波长的同步荧光光谱。在同步扫描的荧光测定中,同步荧光信号强度Is是激发波长的函数,其基本公式为:

　　Is(λex,λem)=KcbEx(λex)EM(λem)

　　式中,c为待测物质的质量浓度,b为试样溶液的厚度,K为实验条件下某常数,Ex为激发光谱的强度分布,EM为发射光谱的强度分布。由(1)式可知,在实验条件保持固定的情况下,测试物质的同步荧光信号强度与待测物质的质量浓度成正比。这是定量分析的依据。在利用同步荧光测试样品前,$K值必须慎重选择,只有当Δλ恰好为某吸收带和其发射带之间的波长间距时,才能观察到同步信号。

　　(2)固定能量的同步荧光光谱

　　固定能量的同步荧光光谱是指在同步扫描过程中,使激发波长与发射波长之间保持着固定的能量差,即使得Δv=(1/λex–1/λem)×107为常数,Δv表示波数差(cm-1)。固定能量的同步荧光法与固定波长的同步荧光法相比较,后者能消除瑞利散射,但是不能消除喇曼散射,反而使喇曼散射加宽。固定能量的同步荧光法既能消除瑞利散射,又可消除喇曼散射,这有利于分析方法灵敏度和精密度的提高,故一般选用前一种方法。

　　同步荧光光谱特点如下：

　　①使光谱简化

　　②使谱带窄化

　　③减少光谱重叠

　　④减少散射光影响

　　6.三维光谱

　　能获得激发波长和发射波长同时变化的光强度信息，有等高线图和三维投影图两种形式。三维荧光光谱法是20年前提出的一种荧光分析新方法。特别是最近提出的三维荧光偏振光谱在研究溶液中荧光物质分子的行为特征方面具有较大的优越性。三维荧光光谱是由激发波长(Y轴)-发射波长(X轴)-荧光强度(Z 轴)三维坐标所表征的矩阵光谱(excitation-emission-matrixspectra),也叫总发光光谱 (totalluminescencespectra),显然该技术可获得激发波长(λex)与发射波长(λem)同时变化时的荧光强度信息。三维荧光光谱图的表示方式有三种,即三维投影图(isometricprojection)、激发发射矩阵(EEM)以及等高线(contourplot)荧光光谱图。用三维投影方式表示的荧光光谱，比较直观，较容易从图上观察到荧光峰的位置和高度以及光谱的某些特性。三维荧光光谱图，由于比二维的平面图多了一个坐标，所得的总荧光数据又比普通荧光光谱多得多，故其具有高选择性。

　　7.高效液相检测技术

　　是荧光光谱分析法在高效液相技术中的应用。它极大的丰富了高效液相的样品检测技术。

　　8.系统灵敏度高

　　可测量低至500uL的样品。

　　三.基本操作

　　(一)样品准备

　　1.液体样品根据用户提供的技术指标，检查浓度范围是否合适，如果需要稀释，则要考虑所需溶剂类型和稀释倍数。

　　2.固体样品均匀粉末、片状或具有光滑平面的块状样品，均可直接测定。

　　(二)操作步骤

　　1.开机：接通电源，打开主机开关，点燃(打开)光源后，根据说明书要求启动计算机。

　　2.检测前准备：参照仪器说明书，在20天内至少进行一次激发校准和发射校准，检测前仪器应预热。

　　3.工作条件的选择：环境温度应在20℃±5℃;相对湿度不大于70%;电源稳定，无磁场、电场干扰。根据样品的特性及荧光强度，选择合适的仪器工作条件(如狭缝、PM增益、响应时间等)。

　　4.基本测定

　　(1)荧光激发光谱测定

　　设置仪器参数，扫描发射波长，找到maxλem，以此为发射波长，记录发射强度作为激发波长的函数，便得到激发光谱。

　　(2)荧光发射光谱测定

　　设置仪器参数，扫描激发波长，找到maxλex，以此为激发波长，记录发射强度与发射波长间的函数关系，便得到荧光发射光谱。

　　(3)差谱测定

　　设置仪器参数，选择合适的工作方式，测定背景溶液的发射光谱并储存起来，在一定的工作方式下，扫描样品溶液的发射波长，得到当时的光度值和储存的背景值之间的差示值，即差谱。

　　(4)峰面积积分

　　选择适当的工作方式，对样品溶液进行积分操作，即得到峰面积积分。

　　(5)荧光强度

　　选择合适的测量参数，设置λex、λem，采用定点读数或扫描方式，即可测得所选波长处的荧光强度。

　　(6)定量测定

　　配制一系列已知浓度的标准溶液，在一定的测定条件下，设置λex、λem，按照由稀至浓的次序，测定标准溶液的荧光强度，绘制荧光强度—浓度的工作曲线，不改变仪器参数测定未知溶液的荧光强度，由工作曲线即可求出未知溶液的浓度。

　　(三)分析结果的表述

　　1.荧光激发光谱、发射光谱以及其他光谱由仪器控制电脑直接绘出。

　　2.峰面积积分、荧光强度由仪器控制电脑计算显示。

　　3.定量测试：在相同的测定条件下，测定一系列已知浓度的标准溶液的荧光强度，绘制出荧光强度-浓度的工作曲线。浓度未知的溶液的荧光强度测定后，由工作曲线求出该溶液的浓度。

　　(四)注意事项

　　1.在实验开始前，应提前打开仪器预热，并配制好所需的溶液，对于已经配制好的溶液，在不用时放在4℃冰箱中保存，放置时间超过一星期的溶液要重新配制。

　　2.实验所用的样品池是四面透光的石英池，拿取的时候用手指掐住池体的上角部，不能接触到四个面，清洗样品池后应用擦镜纸对其四个面进行轻轻擦拭。

　　3.在测试样品时，注意荧光强度范围的设定不要太高，以免测得的荧光强度超过仪器的测定上限。

　　4.实验结束后，要及时的清理台面，处理废液，清洗和放置好样品池，将下次要用的溶液放回冰箱，并且按规定登记实验记录，养成良好的实验习惯。