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标题:【讨论帖】有关异源表达的讨论

windy+++[使用道具]
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11
 
大家介绍一下你做甲醇酵母的经验吧,比如你用了什么筛选方法进行表达子的筛选?如果你没有怎么筛就拿到了好的表达,那么你认为最关键的原因是什么(运气?经验?努力?还是因为选择的基因合适?)

还有希望做其它表达体系的战友也能够参与到本讨论中来,介绍一下你所用的表达体系的特点,以及遇到的一些有代表性的问题及你认为可能的解决方案等等(个人认为即使没有做过的,道听途说也没有关系,只要注明,由战友自己判断可行性即可)。

帖子置顶不容易,不好意思辜负版主大人的一番好意,希望大家支持讨论!
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jiushikeshui371[使用道具]
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看到上面几位的讨论,感触颇深,我也来说几句。
我是做哺乳动物细胞表达的,目前做过几个细胞株的真核表达,也成功的表达了5个蛋白,其中以抗体居多。
其实正如楼上的楼上讲的,哺乳动物细胞表达同酵母表达相比,其最大的劣势在于成本和规模放大。首先,哺乳动物细胞表达时高表达细胞株的筛选是一个相当费时费力费钱的过程,由于外源基因整合位置的不同,导致不同克隆之间的表达差异相当巨大,因此建立一套完善的筛选体系是关键。第二点就是放大成本太大,细胞培养放大非常困难,成本相当高,其关键技术如培养基和流加工艺的控制,目前掌握好这些技术的人在国内屈指可数。
但从另外一个方面讲,哺乳动物细胞表达的优势也是巨大的,首先用哺乳动物细胞表达人源蛋白,由于本身同源性相当强,因此,几乎不用怎么考虑蛋白活性的问题,而这一问题,恰恰是原核和酵母最为头痛的。因此在开发新药上,比其它系统用有无可比拟的优越性。另外,目前,随着哺乳动物细胞表达载体构建的进一步发展,随着细胞培养技术的提升,哺乳动物细胞表达的瓶颈也拓宽了很多,虽然仍然制约着它的进一步发展。
将了这么多,其实我想表明以下观点,哺乳动物细胞表达应该是未来发展的方向和重点,但就目前阶段而言,对不同的蛋白,应选择最适合的表达系统。
以上愚见,抛砖引玉,希望能得到更多的讨论。
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yapuyapu[使用道具]
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说几句吧。
不说大道理了,理论的东西网上到处都是,就谈一下自身的经历。
我开始用pPICZaA和X-33表达一个7kd的小分子蛋白,由于没有电转仪,就用氯化锂转化,获得了几十个克隆,但pcr只扩出10个左右。我用的是溶壁酶,和普通的taq酶扩增的,感觉条带很弱;后来改用高灵敏的taq酶,条带果然亮的多,所以我认为酵母壁很厚,做菌落pcr时一定要用高灵敏taq酶。
获得10个阳性转化子后开始了我漫长的筛选过程,我总认为10个转化子,我通过优化条件总能获得1个有表达的吧,即使只有一点点的表达也可以毕业了。但我就是那么倒霉,我把所有能优化的条件全部都优化了,包括ph,温度,甲醇浓度,培养基的成分;所有的检测手段,tricine sds page,wb,dot blot,elisa,甚至活性。每个条件我都重复3次以上,折腾了半年啊。人差点疯掉,愣是没出来结果。
就在准备辍学时(呵呵),发现了pGAPZaA载体,该载体含有新型组成性启动子,无需添加甲醇诱导。从丁香园战友处得到后重复实验,后来简直是顺利的一塌糊涂。呵呵,这方面的情况下次再聊把。
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windy+++[使用道具]
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QUOTE:
原帖由 jiushikeshui371 于 2013-12-7 22:26 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
看到上面几位的讨论,感触颇深,我也来说几句。
我是做哺乳动物细胞表达的,目前做过几个细胞株的真核表达,也成功的表达了5个蛋白,其中以抗体居多。
其实正如楼上的楼上讲的,哺乳动物细胞表达同酵母表达相比,其最大的劣势在于 ...

目前哺乳动物细胞表达外源蛋白,确实优势明显、劣势也明显。不过我听说一种“细胞发酵”的方法,就是培养哺乳动物细胞(比如CHO),训练其悬浮生长,培养起来类似“发酵”,也有能达到500mg/L的表达水平,相当厉害。不知有没有做这方面的战友,能向大家介绍一下。
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windy+++[使用道具]
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QUOTE:
原帖由 yapuyapu 于 2013-12-7 22:26 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
说几句吧。
不说大道理了,理论的东西网上到处都是,就谈一下自身的经历。
我开始用pPICZaA和X-33表达一个7kd的小分子蛋白,由于没有电转仪,就用氯化锂转化,获得了几十个克隆,但pcr只扩出10个左右。我用的是溶壁酶,和普通的taq ...

看来你的实验跟后来的这种载体pGAPZaA有很密切的关系了?有没有该载体的说明书?向大家介绍一下其特点吧。还有就是我认为你的成功也是与你的努力和经验的积累分不开的,再次祝贺!
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jiushikeshui371[使用道具]
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回复 #14 windy+++ 的帖子

我所在的单位做的就是你所说的细胞悬浮培养,其中以CHO做的最好,悬浮培养最关键的技术在于培养基成分和流加工艺的控制。做的好,细胞能达到很高的密度。500mg/l是很轻松能达到的,我们目前最高记录曾经达到过2g/l的表达量,不过表达的是抗体,而且用于发酵的细胞株已经经过长期的筛选,本身的表达量也很高。
不过,酵母表达我没有实际做过,最近在看这方面的资料,以后还请两位多多指教,呵呵
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uaubc[使用道具]
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jiushikeshui兄表达的的是完整的抗体还是Vfab片段?
还有真核表达时,293和CHO各有什么优势?
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jiushikeshui371[使用道具]
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回复 #17 uaubc 的帖子

我表达的是完整的抗体,不过高变区的密码子,表达载体等都优化过。
293和CHO各有什么优势,这个问题不好说,因为自己感觉做的还不够深入。简单讲一下感受吧:
293的最大优势在于瞬时表达高,转染效率高。基于这两点,因此,在基础研究和开发新药,或者评价表达载体效果是都非常有用。如果不考虑开发新产品,可以于GFP蛋白联用,绝对是研究新蛋白的非常有效的工具。
CHO的优势在于其悬浮培养后,较293能得到更好的控制,较容易放大到大规模。另外一个巨大优势,是CHO可以贴壁,可以悬浮,而且贴壁时非常容易进行细胞筛选,这是293最欠缺的。另外一个巨大的优势,是CHO-dhfr-的应用,在dhfr-MTX筛选扩增机制下,能得到非常高的表达量,因此很适合工业化应用。
以上是我的一些感受,不知道uaubc是从事哪方面研究的,不妨将您的经验与大家分享一下
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yapuyapu[使用道具]
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看来你的实验跟后来的这种载体pGAPZaA有很密切的关系了?有没有该载体的说明书?向大家介绍一下其特点吧。还有就是我认为你的成功也是与你的努力和经验的积累分不开的,再次祝贺!

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我来介绍一下酵母载体pGAPZaA,该载体为INVITROGEN新近开发的组成性表达载体,其主要特点如下:
1。含有组成性启动子GAP,该启动子为1992年开发的。
2。外源蛋白表达时无需添加甲醇,可以减少污染。
3。表达时使用便宜的YPD,不必使用酵母氮源。
4。含有a-因子信号肽,ZEOCIN抗性基因。
本人认为,第2,3点是其最重要优点,也是我选择它的原因,下面是它的PROTOCOL
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yapuyapu[使用道具]
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pGAPZaA的protocol我放在cuturl('http://mail.56.com')里面了,大家可以下载看
下载方法:
1.先注册56邮箱,可以访问下列地址: cuturl('http://mail.56.com')
2.点击“共享资源”,输入sunyong_97,可以看到了。
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