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标题:【讨论帖】有关异源表达的讨论

ritou1985[使用道具]
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我现在在毕赤中表达外源基因就碰到很多问题,我想表达一个有250AA的受体胞外区部分,基因片段是连到pPIC9K上在GS115中做分泌表达,在G418板上筛选后发酵表达,却没有得到预期的表达带,让我很郁闷啊,也不知道是什么原因,请教各位高手了!另外,请问孙医生能否提供pGAPZaA载体给我。我向试一下用你说的这种载体表达,非常感谢!
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damingxia0904[使用道具]
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我是一个做表达的新手,实验屡遭失败,很受打击,向各位高手请教:做半定量RT-PCR看看mRNA是否转录,应该怎样做?
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windy+++[使用道具]
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to yapuyapu:你觉得原来表达不了,后来换载体能表达,是否是因为换了一个强启动子的关系呢?因为感觉那几个主要特点中2.3虽然很好,但是与表达本身关系不大吧?个人意见,请教。
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windy+++[使用道具]
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跟我做的基本一样,我现在也在郁闷中。。。换载体也是个办法,不过不知你的筛选和发酵是如何进行的?又是如何检测的?也许多挑几个就有了(不过这是我老板说的,我挑了快800了,还没有,想换载体了)。祝你好运!
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windy+++[使用道具]
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不知你用的是什么系统表达的?差异比较大,不用心急。如果是整合到基因组表达的话,提细胞总RNA,设计特异引物RT-PCR反转录(注意设计内对照,一般是beta-actin之类的管家基因)。具体做法可到PCR版请教。祝好运!
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uaubc[使用道具]
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表达的是完整的抗体,不过高变区的密码子,表达载体等都优化过。
293和CHO各有什么优势,这个问题不好说,因为自己感觉做的还不够深入。简单讲一下感受吧:
293的最大优势在于瞬时表达高,转染效率高。基于这两点,因此,在基础研究和开发新药,或者评价表达载体效果是都非常有用。如果不考虑开发新产品,可以于GFP蛋白联用,绝对是研究新蛋白的非常有效的工具。
CHO的优势在于其悬浮培养后,较293能得到更好的控制,较容易放大到大规模。另外一个巨大优势,是CHO可以贴壁,可以悬浮,而且贴壁时非常容易进行细胞筛选,这是293最欠缺的。另外一个巨大的优势,是CHO-dhfr-的应用,在dhfr-MTX筛选扩增机制下,能得到非常高的表达量,因此很适合工业化应用。
以上是我的一些感受,不知道laboy是从事哪方面研究的,不妨将您的经验与大家分享一下

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兄台这一番介绍,让我对这个陌生领域稍微有所了解。
不知道你所讲的vfab的密码子和载体都作为优化是怎么样的优化。
我是做下游纯化的,尤其是抗体纯化做的比较多,对抗体技术懂点皮毛,呵呵
还要向各位多学习。
有没有重组抗体及在293,CHO细胞方面应用上简单明了一点的文章或者著作,介绍一下
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jiushikeshui371[使用道具]
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回复 #26 uaubc 的帖子

关于Vfab密码子的优化以及载体优化的细节由于工作关系,不方便在版上讨论,请见谅。
至于293,CHO细胞应用方面的文章其实我到觉得你可以在版上,以以下关键词搜索:真核表达, G418筛选,瞬时表达,克隆筛选等,能得到一些应用和细节方面的东西。要是想得到更概念化的理解,还是建议有机会自己尝试走一个过程就能更深刻的理解了。
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mickeylin[使用道具]
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to  yapuyapu:我也是做毕氏酵母的,希望战友以后多多指教,小弟先谢谢了,我现在用的是PPIC9K载体,虽然没有其他的载体,宿主菌是GS115,已经转了一个分子量大约是22左右的蛋白,也出现了目的大小的条带,不过好象要大那么一点点,你的是不是也出现类似情况.就是没有抗体验证是否是需要表达的蛋白,听你说发了一篇SCI,我想具体的听听你做了那些方面的工作,就够这个档次了,还有是投的哪个杂志,另外就是想听听你的经验和心得包括实验和投稿时候的.小弟不胜感激.
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yapuyapu[使用道具]
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回复 #28 mickeylin 的帖子

你好,指教谈不上,大家互相学习嘛
1.“也出现了目的大小的条带,不过好象要大那么一点点”
我也出现这个情况了,我的目的蛋白8KD,但是跑胶显示为10KD,可能是糖基化所致。
2.我是从RT-PCR开始,到表达、纯化、wb鉴定,氨基酸测序,功能研究
3.我发的杂志是protein expression and purification,其实我的工作很常规,能不能发sci主要看你的工作是不是原创,如果表达的蛋白早就有人发过文章了,那就困难了。
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windy+++[使用道具]
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protein expression and purification是个不错的杂志,我的一个师兄也是在那里发的论文,恭喜呀!

我也认为蛋白变大应该是糖基化程度不同所致,会比光从序列预测的分子量大一些的
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