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标题:【讨论帖】有关异源表达的讨论

jiushikeshui371[使用道具]
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By the way, 菌种保存不宜用20%甘油,用9-10%最合适,就像细胞培养保存一样,否则,质粒易丢失。楼主在“4. 菌种的保存、退化”中提到的问题即是这个原因造成的。

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不知道您上述的结论有无数据支持。谢谢!
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jiushikeshui371[使用道具]
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以上就是最近的一点心得,请大家指教!

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谢谢您的经验分享,我也说说我做的动物细胞培养上面几种抗生素的使用感受:

1.G418 还是首选的筛选用抗生素,细胞死亡情况很明显,压力上去后能发现细胞很明显的死亡,只需要维持压力1周多就能出克隆。推荐用Merck的G418,比较便宜,效果也好。最近试用了厦门太阳马的G418,感觉也还不错,不过稳定性有待考察。G418压力,一般我最高用1.5mg/ml,逐渐升压。

2.Hyg hygromycine筛选较G418稍慢,细胞死亡稍慢,细胞死亡时也是变小死亡。最高压力我用到过2.0 mg/ml ,不过从1.2-2.0的压力范围,我觉得细胞变化不大,克隆率也差不多。

3.Zeocin 用于细胞筛选是最慢的,细胞是先变大,然后破掉。这之间细胞是慢慢死光的,最高压力需要维持2周多才能将细胞杀光。不过压力可以用的比较低,从0.4 mg/ml 往上差别不是太大。

以上是最近用了三种筛选系统的一点心得。
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回复 #42 jiushikeshui371 的帖子

您说的那三种抗生素,在酵母表达中Hyg hygromycine没有用过,但是G418和Zeocin都用了

G418抗性在pPIC9k等载体上,感觉在酵母表达时使用不是很好,因为主要是用于筛选高拷贝菌株,用量也比较大,本人是没有做出很好的效果。不过确实该抗生素在细胞筛选中应用更为广泛一些

Zeocin感觉在菌种筛选方面的作用还可以,不足及问题上面已经讨论过
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By the way, 菌种保存不宜用20%甘油,用9-10%最合适,就像细胞培养保存一样,否则,质粒易丢失。楼主在“4. 菌种的保存、退化”中提到的问题即是这个原因造成的。

不知道您上述的结论有无数据支持。谢谢!”

这个我也是有疑问,请教!谢谢!
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zbboom[使用道具]
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关于菌种保存,完全是正反两方面的经验--我也有过质粒丢失的时候,不过数据倒有pET的技术支持提供的非实验数据。同时,我现在就是采用9-10%这个浓度保存菌种,没有出现问题。加甘油时要注意的是:剪去200ul的枪尖(约1cm),调节移液器至菌液体积的1/10(即700ul的菌液加70ul甘油),抽吸甘油一下,再吸取甘油直接打入菌液即可。

关于蛋白表达与纯化,我可能也不是专家,只是用的都是最好的表达系统,纯化是借助AKTA FPLC系统上离子交换、分子筛、亲和等,前期构建相对轻松,后期纯化投入的精力和时间却比较多。
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moonlight45[使用道具]
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Hi, there,

Here are something about rare codon that I know. Hopefully the following is usefulSmile

1 There are mainly five rare codons for E. Coli:
AGG, AGA for Arg (codon usage: 0.003 and 0.006, respectively);
ATA for Ile (0.006);
CCC for Pro (0.016);
CTA for Leu (0.008).

2 Usually, the clusters of rare codon in N-terminus, especially near the start codon can dramatically impact the expression level.

As SmallDonkey said, Rosetta is designed to solve the problem. The sequence should be checked before cloning and expression. I mean, it a part of project for recombinant expression.

A strain from Strategen, named BL21 DE3 codonplus RIPL (where RIPL are the one-letter for the four amino acids), a well known strain, is also competent for express heterogenous protein with rare codons. As in a paper published in Nature, 2007, the authors express three protein successfully using this strain. Note that there are 24-32 rare codons in each protein, which contain 240-320 residues.
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箭头儿[使用道具]
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关于菌种保存,完全是正反两方面的经验--我也有过质粒丢失的时候,不过数据倒有pET的技术支持提供的非实验数据。同时,我现在就是采用9-10%这个浓度保存菌种,没有出现问题。加甘油时要注意的是:剪去200ul的枪尖(约1cm),调节移液器至菌液体积的1/10(即700ul的菌液加70ul甘油),抽吸甘油一下,再吸取甘油直接打入菌液即可。

关于蛋白表达与纯化,我可能也不是专家,只是用的都是最好的表达系统,纯化是借助AKTA FPLC系统上离子交换、分子筛、亲和等,前期构建相对轻松,后期纯化投入的精力和时间却比较多。

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Hi,

Thank you for your experience on strain storage. It is useful for me.

However, I would suggest you to use diluted glycerol for doing this. You know, the 100% glycerol is too sticky to drop properly. I think most people using 80% glycerol.
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windy+++[使用道具]
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BL21 DE3 codonplus RIPL这个菌种还真是没有见过,不知哪里会有?

另外我使用40%的甘油,与菌液对半加,所以终浓度是20%,如果10%的话就加1/4好了Big Smile

感谢amberly 版主参与讨论!带来了不少新的信息!另外版主英语好好。。。本人英语一直有点遗憾,到时一定请教一下,帮帮我呦Big Smile
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