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标题:【讨论帖】我在SDS-PAGE中所犯的错误

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发表于 2013-12-12 16:59 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
蛋白质电泳用的缓冲液应是Tris-甘氨酸，TBE是用来电泳核酸的；

10×一般指的是10倍深度，用时稀释成1倍。
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发表于 2013-12-12 17:00 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

虽然此帖发了快一年了,但我还是和大家分享一下我的经验,希望对后来者有些须帮助:
1.用琼脂糖封胶好象优点奢侈,除了用琼脂粉以外还可以用12.5%的淀粉,煮沸致透明即可.
2,APS配好后可用EP管分装,保存于-20度
3,一般的电泳仪的正负接头都有颜色指示,红色示正极(bio-rad),有的(大板)红色指示的却是负极.
4,marker点了就好分辨点样顺序,可不用切角,但不点marker时却必须点上.
5,剥胶时可把浓缩胶刮掉,一边用流水冲洗一边剥,这样比较保险.
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发表于 2013-12-12 17:01 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
10% 的SDS放在室温或4℃都会出现沉淀,加热一下就可以了.
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发表于 2013-12-12 17:01 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
请教几个问题：
1、我的胶凝后总有少量水分析出，是否正常？
2、按照分子克隆配的12％胶20kDa的蛋白跑不出来，且染料的位置有一条深染的条带，只有15％的胶下面条带才消失，我跑的是细菌总蛋白，是否是因为胶的实际浓度低所致？
3、细菌沉淀直接加2×buffer，煮沸5分钟变性，离心后上样，是否可行？为什么有的样品稀，有的样品特浓，上样都困难，跑出来后严重脱尾？
4、哪位高人有蛋白表达方面的经验请指教！xue_yj@163.com

回答:
1,正常;
2,12%跑20kD没问题的;
3,细菌沉淀我们是加1倍的buffer,沸水煮8-10min,小离心机12000rmp5-10min;煮的时候要小心EP管,没盖严或崩开的话样品就会有特浓的情况发生.
4,这里有很多做过蛋白表达的,本人做过三年.
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发表于 2013-12-12 17:02 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
今天做胶,所用凝胶储液,分离胶和浓缩胶BUFFER都是去年11月底的,居然也凝固了,不知这样的胶能否用来电泳?
另外在灌胶时发现分离胶和浓缩胶溶液里都有少量白色絮状沉淀,不知是不是溶液放置太久之故还是本身就有的,因为以前做实验时也发现过类似的现象.
谢谢指点!
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发表于 2013-12-12 17:04 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

最近一直跑同工酶，不知道大家凝胶时是什么温度？个人认为高温下使凝胶快速聚合比较好，特别是4mm的厚板，根本不用封水，特别平。常温下自然聚合经常会出现锯齿状的边缘，就是不知道对电泳有没有影响。感觉没什么差别
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发表于 2013-12-12 17:04 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
琼脂是可以封底的，我们实验室一直在用哦，而且效果很不错。凝固几分钟就可以了
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发表于 2013-12-12 17:05 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我也在做SDS-PAGE 的电泳,使用的是恒压,请教各位一个问题:
电压大小和分离样品的性质关系怎么样?大了好还是小了好啊?
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发表于 2013-12-12 17:06 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我也在做SDS-PAGE 的电泳,使用的是恒压,请教各位一个问题:
电压大小和分离样品的性质关系怎么样?大了好还是小了好啊?
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orangecake[使用道具]
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发表于 2013-12-12 17:06 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

琼脂粉可以用的，我就是用这个，其实没什么影响的，2％的琼脂粉凝结的很慢，我每次用4％啦，从没出现过漏胶的问题。另外SDS我也是常温放着的，TEMED我是常温避光放置，AP 4度保存。丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺不能久置，最好新配。其它的问题也就是熟练而已啦。
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