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标题:【讨论帖】我在SDS-PAGE中所犯的错误

glass[使用道具]
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发表于 2013-12-12 16:25 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我的AP是分装成小管，放－20保存，每次用一管，印象中半年是没问题的。TEMED是放4C。其它常温放置。另外配制顺序最好是TEMED先加，然后再加AP，因为没有TEMED，AP也可以引发聚合反应，只不过速度稍慢一些，对于学过高分子的人这些最清楚。
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kuaizige[使用道具]
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发表于 2013-12-12 16:26 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
请教几个问题：
1、我的胶凝后总有少量水分析出，是否正常？
2、按照分子克隆配的12％胶20kDa的蛋白跑不出来，且染料的位置有一条深染的条带，只有15％的胶下面条带才消失，我跑的是细菌总蛋白，是否是因为胶的实际浓度低所致？
3、细菌沉淀直接加2×buffer，煮沸5分钟变性，离心后上样，是否可行？为什么有的样品稀，有的样品特浓，上样都困难，跑出来后严重脱尾？
4、哪位高人有蛋白表达方面的经验请指教！
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zhenxin[使用道具]
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发表于 2013-12-12 16:27 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
琼脂粉可以用作封底胶。我们实验室一直在用！物虽不很美，但价廉！
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发表于 2013-12-12 16:27 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我跑12%的胶，没出现过你说的深带。
我一般是细菌沉淀直接加样品buffer，再加5ul的巯基乙醇，混匀，离心，煮沸10min，直接上样，效果还行
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kuohao17[使用道具]
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发表于 2013-12-12 16:28 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
1。可用聚丙酰胺快速胶（加大AP和TEMED的浓度）封底；
2。AP -20C分装保存，可至3个月；
3。做好分离胶后，要小心地用水封，避免空气影响胶的聚合；
4。细菌沉淀加1XBuffer，可溶性样品加2XBuffer，煮5min，上样10-20ul；
5。剥胶用Bio-Rad的剥胶塑料板非常方便，用注射器注水冲的方法易搞破胶。
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发表于 2013-12-12 16:28 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
琼脂粉可以用作封底胶。我们实验室一直在用！物虽不很美，但价廉！

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你用的琼脂粉是多大浓度的，我用2%都不能好。
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xingyi08[使用道具]
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发表于 2013-12-12 16:29 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我用1%的琼脂封胶效果很好，有时候琼脂的质量不同，用的浓度就不同，我们实验室发现即使是同一厂家不同的批次质量都不同，你的琼脂可能质量不好，你可以加大浓度试试。
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发表于 2013-12-12 16:30 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

细菌沉淀用1×或2×buffer有什么区别吗？
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utt0989[使用道具]
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发表于 2013-12-12 16:30 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
胶的配方大家的实验室都应该做过一些修订，能否公布出一些大家觉得效果比较的胶的配方？
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6327555[使用道具]
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发表于 2013-12-12 16:31 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


QUOTE:
原帖由 utt0989 于 2013-12-12 16:30 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
胶的配方大家的实验室都应该做过一些修订，能否公布出一些大家觉得效果比较的胶的配方？

我参考的是：汪家镇的＜蛋白质技术手册＞，那本书还是很常用的。
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