表观遗传学

2008年早期，美国国家卫生研究院NIH发起了一项表观基因组学项目。今天这些努力开始初见成效，NIH共同基金等资助了68项表观基因组学项目，获得了52份表观遗传图谱（不同细胞类型DNA甲基化和组蛋白修饰图谱），但是更重要的是，通过这些研究，我们获得了大量新型表观遗传学和表观基因组学的分析技术……

生物通报道：2008年早期，美国国家卫生研究院NIH宣布了一项涉及1.9亿元，时间长达5年的表观基因组学项目，这一项目作为NIH“路线图计划”（RoadMap Initiative）的组成部分，总体目标包括几个方面，比如绘制正常人类细胞和组织表观遗传系列参考图谱，研发新型研究工具等。

今天这些努力开始初见成效，NIH共同基金与一些私人研究机构已经资助了68项表观基因组学项目，获得了52份表观遗传图谱（不同细胞类型DNA甲基化和组蛋白修饰图谱），在去年9月，相关研究人员发表了30篇论文，介绍了这些研究成果，也解析了相关的转录因子结合位点，染色质高级结构，转录区域，以及将近150个细胞系中的更多人类基因组以外的信息。

而且更重要的是，通过这些研究，我们获得了大量新型表观遗传学和表观基因组学的分析技术，令我们更清楚的了解了基因组水平上细胞内发生的事件。正如NIH共同基金办公室主任James Anderson所说的那样，这些才是花费上百万美元的真正收获。

由此Science杂志特以“Epigenomics: The New Technologies of Chromatin Analysis”为题，总结概况了这些技术，文章分为甲基化分析，组蛋白分析，以及分离分选技术。

紧抓“甲基化”

获得表观基因组学项目Epigenomics Program资助的其中一位研究人员，是来自加州大学圣地亚哥分校路德维希癌症研究所的华人科学家任兵（Bing Ren，音译），作为这一项目四大关键表观遗传学图谱研究中心之一的研究院首席研究员PI，任兵的研究方向为胚胎干细胞表观遗传学。自2008年以来，圣地亚哥表观遗传学中心已经资助了1570万美元，用于绘制人类胚胎干细胞和四种干细胞分化细胞类型的DNA甲基化图谱，以及20个组蛋白修饰的图谱。

任兵表示，表观遗传学项目的重要性“与人类基因组测序技术的重要性相当”，“有了人类基因组图谱，就有了了解人类发育的蓝图，但是如果没有一个详细的表观遗传学解析图谱，我们就无法解读这个蓝图。”

圣地亚哥表观遗传学中心主要是通过两项技术来实现其研究目的的，分别是染色质免疫沉淀-测序技术（ChIP-Seq），以及MethylC-Seq，前者采用了新一代DNA测序技术，分析基因组中特异性组蛋白修饰位点，后者则是一种检测5-甲基胞嘧啶（5-methylcytosine，5-mC）修饰位点的全基因组方法。

从根本上说，MethylC-Seq技术实际上就是Bisulfite Sequencing (BS-Seq)方法的优化版本，它所解决的问题在于：标准DNA测序方法无法将5mC和胞嘧啶区分开来，而当用亚硫酸氢钠处理DNA的时候，由于这种化合物能将未修饰过的胞嘧啶变成尿嘧啶，DNA测序仪上显示为胸腺嘧啶（T），因此比较处理后和未处理的样品，就能找到被甲基化修饰的碱基了。

早在十年前，就有研究人员利用重亚硫酸氢盐转化方法分析过甲基化，2008年Salk研究院的Joseph Ecker研究组在Illumina的 Genome Analyzer上更新了这种技术，这就是MethylC-Seq方法。

然而去年，两个研究组：洛克菲勒大学的Nathaniel Heintz，以及哈佛大学的Anjana Rao，分别独立发现了哺乳动物中一种之前未知的甲基化形式：5-羟甲基胞嘧啶（5-hydroxymethylcytosine，5-hmC）。

事实证明，重亚硫酸氢盐测序方法无法区分5-mC和5-hmC，这也就是说至少一些已报道位点可能是两者中的一种。

为此，NEB推出了一种分析试剂盒，EpiMark，这是市场上第一个定量5-hmC的PCR型分析，且操作简便，只需三步。它利用T4 β-葡萄糖基转移酶（T4-BGT）在5-hmC的羟基上添加葡萄糖，从而区分5-mC和5-hmC。当5-hmC出现在CCGG的背景下，这种修饰将一个可切割的MspI位点转化成不可切割的。（更多详细内容>> >> ）

而且在2012年，研究人员也最终发现了解决这个难题的方法，首先来自英国的一组研究人员发明一种称为氧化重亚硫酸盐测序（oxBS-Seq）的方法，这种方法利用高钌酸钾将5-hmC氧化为5-fC。在用重亚硫酸盐处理后，5-fC（就像胞嘧啶）测序读取为T。同理，将标准重亚硫酸盐处理的DNA序列与oxBS-Seq DNA序列相比对就能够区分5-mC与5-hmC。

第二种方法则是通过任兵，芝加哥大学何川，以及埃默里大学的金鹏（音译）三位科学家合作完成，这种TAB-Seq（Tet-assisted bisulfite sequencing，Tet辅助重亚硫酸盐测序法）利用广泛认可的新一代DNA测序方法实现了对哺乳动物基因组所有5-hmC的精确定位。TAB-Seq利用TET蛋白的活性将5-mC氧化为5-caC。在用亚硫酸氢钠处理时，5-caC就像未修饰的胞嘧啶一样被转化为尿嘧啶。该方法先用beta-葡萄糖基转移酶将5-hmC糖基化保护起来。随后用TET处理DNA，使其他甲基化胞嘧啶转变为5-caC。最后再用重亚硫酸盐处理DNA。在测序过程中，所有胞嘧啶和5-甲基胞嘧啶都被读为T，而5-hmC仍然为C。将这一数据与标准重亚硫酸盐测序生成的数据相比，就能使研究人员确定哪个碱基包含何种修饰。