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荧光探针广泛应用于今天的细胞、分子，甚至是小动物的生物学研究。事实上，研究人员可用的荧光探针如此之多，那么为什么要开发新的探针，以及如何开发呢？卡耐基梅隆大学的化学与生物学副教授Marcel Bruchez谈道：“我们先从生物学需求来看这个问题。我们想要看到什么，但现有探针还无法满足。”研究人员通过创造新的荧光探针，或改进现有的探针，来满足这一需求。

  

研究人员往往会尝试改进现有探针的性能，如光稳定性或亮度。卡耐基梅隆大学化学系教授Bruce Armitage谈道：“我们正在学习如何在染料中加入取代基，让它们没那么容易光漂白，这意味着探针标记的东西可在较长的时间内成像。”

  

一旦您确定了对新探针或改进探针的需求，下一步就是详细的设计和优化过程了。Bruchez笑称，开发一种新探针是“一半理性设计，一半机会主义”。

  

从量子点到探针

  

在开发荧光探针之前，Bruchez可谓量子点方面的先驱。量子点（quantum dots）是微小的纳米晶体，可用于标记蛋白或细胞。为了将这项技术商业化，Bruchez在1998年创立了Quantum Dot公司，这家公司在2005年被Invitrogen收购。在Quantum Dot，Bruchez接听了大量的电话，他居然很享受。“每一个电话都是一个潜在的科学项目。我建立了许多合作，至今仍记忆犹新。”

  

但他也知道，这对业务而言不是最好。“这次经历教会我提供终产品的价值，也就是承诺做一个特别的东西，并始终坚持。”如今，Bruchez在新公司中也一直铭记这一点。Sharpe Edge Labs是他与卡耐基梅隆的同事Alan Waggoner共同创立的，出售受体运输和通道的分析。

  

尽管量子点技术仍在不断发展，但Bruchez不再参与其中。相反，他被吸引到未知的领域。例如，他最近的工作是开发一款pH传感器探针，用于活细胞表面表达的G蛋白偶联受体（GPCR）的标记1。之前的方法是让标记的膜蛋白通过内吞作用吸收，再利用胰酶剥离细胞表面的其他蛋白。

  

相比之下，Bruchez的研究小组开发出一种更快且更方便的颜色变化分析，这是基于分子内能量转移。该分析让细胞表面的受体发出一种颜色的荧光，而囊泡内的内化受体发出另一种颜色的荧光。

  

Bruchez谈道：“从生理上看，内吞的受体经历pH的变化，于是我们推测，pH传感器可以给我们带来表面和胞内部分的数据，同时，还有一些内吞池pH平均值的信息。染料在表面结合，带有一个未激活的pH敏感性发色团，发出绿色荧光。一旦内化，pH依赖的染料被激活，荧光从绿色变为红色，而激发波长相同。”

  

荧光化合物库的帮助

  

与此同时，其他实验室正在采用不同的方法来开发荧光探针。例如，新加坡生物成像协会的Young-Tae Chang正在使用一种被称为DOFLA（diversity-oriented fluorescence library approach）的方法。这种技术让研究人员能够利用一个小型、结构多样的荧光化合物库来调整探针。

  

Chang认为：“当靶点或生物标志物不明确时，这特别有用。例如，为了制造干细胞选择性的探针，但对细胞类型又不是特别了解，我们就利用荧光化合物库对干细胞进行了基于图像的筛选。到目前为止，我们已经制成了10,000多种化合物，根据我们的经验，通过这种类型的筛选来寻找选择性的探针几乎是100%成功的。”

  

最近，这个研究小组正利用DOFLA来创建胚胎和神经干细胞的荧光探针。Chang设想，这些工具可取代当前基于抗体的方法，用于干细胞的检测、分离或重编程。也许并非每个人都能使用DOFLA方法，因为它需要纯或富集的干细胞培养物。不过，它却具有治疗上的希望。

  

Chang谈道：“癌症干细胞将是下面重要的一步，可靠的培养条件将是关键。一旦观察到，它们将被杀死。这是我们下一步的行动。”

  

在另一种以库为基础的方法中，Armitage的研究小组正在使用合成的荧光染料，从组合库中选择蛋白质，它们将与染料结合，并激活荧光。他们将这种染料加蛋白质的复合物称之为荧光模块（fluoromodule），这有可能变成像GFP一样的标签，应用于蛋白定位和功能研究。最近，他们开发出在405 nm下激发的荧光模块，以及与几种染料结合的蛋白质，这样它就能覆盖几乎整个可见光谱。

  

荧光的未来

  

Bruchez预计，未来荧光探针的发展将侧重于能将细胞内的蛋白标上多种颜色的工具，以及适用于电生理学、超分辨率成像和蛋白相互作用的染料。“你可将新的探针直接放入内源的基因位点。这样细胞产生的蛋白拷贝上就直接带有荧光探针，而不是在表达质粒上添加新的拷贝，”Bruchez说道。

  

然而，标记的主要瓶颈在于产生稳定转染的细胞系或转基因动物需要大量的资源。一个仍然很吃香的解决方案是标记内源蛋白。Bruchez表示：“适体分子信标和荧光适体开关等方法都显示出这个方向的一些希望，但新方法还需要强调一点。这些传感器必须是明亮的、特异的、稳定的，能够进入活细胞，而不需要剧烈的处理。”

  

Armitage同意，在避免过表达的同时，也很难找到具有足够灵敏度、亲和力、亮度和光稳定性的荧光探针，但仍有成功的希望。Armitage谈道：“将细胞内表达与外源性染料的标记相结合的技术是有希望的，但仍有大量工作有待完成。”