生物技术服务

该研究利用短发卡RNA(small hairpin RNA, shRNA)表达载体沉默HT9急性早幼粒白血病耐药细胞MDR1基因表达, 以提高细胞对三尖杉酯碱、阿霉素的敏感性。通过设计合成编码shRNA的DNA模板序列, 定向克隆到pSilencer 2.1-U6 neo质粒, 成功构建1个P-gp蛋白基因特异的shRNA表达载体, 稳定电转染HT9细胞, 实时荧光定量PCR分析MDR1 mRNA表达, Western blot检测细胞P-gp蛋白表达, 流式细胞术检测P-gp蛋白外排泵功能, MTT法检测细胞对药物敏感性。结果显示, 成功构建了shRNA表达载体pSilencer 2.1-U6 neo-MDR1, 转染HT9细胞后, PCR检测重组质粒整合到HT9/sh-2.1-1细胞基因组DNA, 获得稳定遗传; HT9/sh-2.1-1细胞MDR1 mRNA表达降低了78.84%(P<0.01), P-gp蛋白表达降低了48.27%(P<0.05), 细胞内Rho123相对荧光强度由(10.8±0.58)%升高至(73.56±1.37)%; 转染细胞对三尖杉酯碱、阿霉素敏感性明显增强, IC50分别由(2.06±0.15) μmol/L降至(0.57±0.01) μmol/L、(4.04±017) μmol/L降至(1.56±0.05) μmol/L。提示shRNA干扰表达载体pSilencer 2.1-U6 neo-MDR1能够稳定、持久地抑制MDR1基因表达, 并能有效增强HT9细胞对三尖杉酯碱、阿霉素的敏感性。