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标题:【求助】】帮看看我的血清去高丰度蛋白后的2DE效果......

she[使用道具]
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【求助】】帮看看我的血清去高丰度蛋白后的2DE效果......


这是我最近做的2DE的图,新手,请各位帮看看去除高丰度蛋白的效果如何?感觉好差,这些图存在的主要问题是什么?拖尾比较严重,主要是我放胶条的时候,为了贴紧胶,用胶片搓到了~~


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2013-12-18 17:44
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she[使用道具]
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这个是去了高丰度蛋白的,用的是默克的去高丰度蛋白试剂盒,说明书说每次过柱子可以上20~60微升,我上了50微升,胶条上样量为1mg,胶条是24CM,PH3~10,NL,染色方法为胶体G250考染


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各位高手提提改进意见,谢谢~~有谁用过默克的去高丰度蛋白试剂盒不?效果如果啊?我感觉怎么效果不是很好的,是不是我过柱子的原血清的量大了点
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jujuba[使用道具]
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默克公司试剂盒去高丰度蛋白效果还可以,一般人血清效果最好,不知道你的是不是,看你上面描述,我感觉主要原因是血清量上的过大,一般按照说明书建议的50ul稀释十倍,过一个柱子,一般可以回收700ug左右,去除效果不错的;给出以下建议1、如果可以的话就用银染,可以用少量的样品(100ug-150ug/块胶),跑三个平行样品量就足够了。2、血清蛋白pI分布比较集中,可以缩小范围,你可以自己用尺子测量下,建议可以用PH4-7的胶条。3、如果必须要考染的话,就多费几个柱子了,血清上样柱子最好不要太大,否则效果差强人意了。
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she[使用道具]
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我的上50微升,一个柱子大概得到800到900微蛋白~~我一下子把买的柱子都给过了~~55555555555,都是过50微升~所以现在比较被动了~~感觉去除的效果不是很理想啊,呵呵
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jujuba[使用道具]
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你跑下4-7的试下吧,聚焦时间在现有的基础上再延长一些
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好的,谢谢楼上分析
我的聚焦时间
先G 8000 1H,然后 STEP 8000 65000伏时了,还要继续延长吗?
胶条都已经买了,呵呵,都是PH3~10的,所以估计不改了,现在感觉主要是高丰度蛋白去除效果不好啊··还有点拖尾现象,胶体考染G250上样量达1毫克,上样量应该不大啊,但是还是有横纹现象了
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yjf1026[使用道具]
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血清样品本来就是比较难跑的,你这样的图也不算很差,不过有如下一些意见和建议供参考:
1,SDS-PAGE跑得时间不够,可以再跑一段时间,让蛋白整体向下跑一点,另外,可以更改一下SDS-PAGE的浓度,将浓度调低一些,因为你有很多的大分子量的蛋白。
2,提取血清蛋白一般都会用试剂盒去除高丰度蛋白的,你再摸索一下,用哪个厂家的产品比较好?该如何操作?减少高丰度蛋白去除柱的上样体积,使充分去除高丰度蛋白,在这一方面,不要太计较费用,一定要保证质量,你以后需要做鉴定的话,我给你推荐一个比较好的单位,费用也就省下来了。
3,聚焦时间还要加长,可以把你的聚焦程序修改如下:
1 S 50v 10-12H
2 S 100V 1H
3 S 200V 1H
4 S 500V 1H
5 S 1000V 1H
6 G 8000V 1H
7 S 8000V 最少13小时(约为104000Vhours)
8 S 500维持
祝好!
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yjf1026[使用道具]
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你按照这些意见做修改后看看,应该会有一些改善的!另外,不管做得好不好,都期望能把结果发上来再让大家看看,有助于更多人的学习与交流!
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建议你的聚集时间大于95000vhr 4-7的胶条效果会好一些,下面是我做出来的结果,这个是大鼠血清的,如果你的是人血清的话 效果应该更好一些。


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