【求助】蛋白纯化后无吸收峰 - 经验共享

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标题:【求助】蛋白纯化后无吸收峰

ukonptp[使用道具]
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发表于 2013-12-27 10:52 资料个人空间短消息加为好友

小中大

思路应当是先确定存在，然后寻求位置，最后从该位置/梯度中得到目的产物
期待你的结果！

gemei0115[使用道具]
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发表于 2013-12-27 10:52 资料个人空间短消息加为好友

小中大

电泳证实有目的蛋白。是不是我的目的蛋白上清表达太少啊？我的目的蛋白形成包涵体比较多，但我看好多战友说蛋白复性很困难，于是我就降低温度表达，但今天纯化了一次也没有吸收峰，请各位大侠多多指教

gogo[使用道具]
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发表于 2013-12-27 10:53 资料个人空间短消息加为好友

小中大

QUOTE:

原帖由 gemei0115 于 2013-12-27 10:52 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

电泳证实有目的蛋白。是不是我的目的蛋白上清表达太少啊？我的目的蛋白形成包涵体比较多，但我看好多战友说蛋白复性很困难，于是我就降低温度表达，但今天纯化了一次也没有吸收峰，请各位大侠多多指教 ...

没有吸收峰是不合情理的。高浓度的咪唑在OD280A处也有一个峰的。
即使你的蛋白完全没有吸附，换用100mM 咪唑250mM 咪唑500mM 咪唑时，都有一个个台阶峰出现。
检查系统连接、检测器是否正常。
我的经验，如果你的蛋白有可溶性表达存在，那么包涵体复性（仅仅指去除变性剂）也不会很困难。当然能用上清纯化到目的蛋白最好，但是绝对不要怕做包涵体。

gemei0115[使用道具]
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发表于 2013-12-27 10:53 资料个人空间短消息加为好友

小中大

谢谢各位老师的指点！
我放弃上清纯化，采用纯化包涵体的办法，结果纯化的条带非常好，下一步继续做复性，还请各位老师给点意见，谢谢

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