样品前处理

麻烦给位亲解答一下困扰我大半年的难题。我最近在做DNA甲基化，用荧光定量来检测甲基化程度，以下是我的目的片段，

ccccgc accaatagga tcctcccgaa tcaaccctga

cccctctcct tcataaatta ttcagcttcc tacactatta aagtttacca caaccaccac

cccatcatac tctttcaccc acagcaccaa tcctacctcc atcgctaacc ccactaaaac

actcaccaag acctcaaccc ctgaccccca tgcctcagga tactcctcaa tagccatcgc

tgtagtatat ccaaagacaa cc

用甲基化软件设计就只有一对甲基化引物，但是在上荧光定量的时候，引物的扩增效率很低，而且在标准品质粒上10的5次方就有引物二聚体，10的3次方就只有引物二聚体，没有目的条带了。
各位大师，我该怎么解决这个难题，引物截短点行不行，如果可以的话，要怎么截啊。

我的引物是 甲基化正向引物----TTTCGTATTAATAGGATTTTTTCGA （25bp）
反向引物---AATTATCTTTAAATATACTACAACGAT （27bp）

非甲基化正向引物----TTTTGTATTAATAGGATTTTTTTGA （25bp）
反向引物----ATAATTATCTTTAAATATACTACAACAAT （29bp）

具体的设计，如果有文献报道，那么是最理想的。如果没有的话，看看你感兴趣的基因是否有商业化的试剂盒。这个比较简单。

此外，对于甲基化引物设计，可以尝试如下的一个软件看看。
For MSP primer design, please use the MethPrime software package.
cuturl('http://www.urogene.org/methprimer/')
原则以及方法可以参考如下一个帖子：
cuturl('http://www.51atgc.com/shiyanjishufangfa/PCRshiyan/jiajihuaPCR/2011-03-11/8553.html')
一般情况下,甲基化PCR引物的长度在20~30bp。MethPrimer 默认的引物长度在20~30bp,25bp为最适长度.

对于降低引物二聚体，提高PCR严谨性(包括提高退火温度，降低引物浓度等)可能能帮助降低二聚体的浓度。