【求助】用氯化钙制备DH5a感受态 - 经验共享

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标题:【求助】用氯化钙制备DH5a感受态

qumm1985[使用道具]
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发表于 2014-1-8 16:56 资料个人空间短消息加为好友

小中大

QUOTE:

原帖由 JK.jon 于 2014-1-8 16:55 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

建议你在转接后只摇2个小时，做出来的效果就很好！

谢谢！
请问：1 挑选平板上的几个菌落在一毫升lb中培养多长时间，再转接。
2 平板上的菌在4度放几天还能用吗？

mickeylin[使用道具]
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发表于 2014-1-8 16:56 资料个人空间短消息加为好友

小中大

首先，CaCl2的感受态效率没有问题，做了几十个载体了，全部用这个。制备好感受态后转化0.2-0.5的空载体可以检验下转化效率。另外，菌种在4度放几个月也没问题。只是活性低一点。质粒的稳定性是很高的，把滤纸上的区域剪下来加点灭菌水，离心下即可用。

kswl870[使用道具]
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发表于 2014-1-8 16:56 资料个人空间短消息加为好友

小中大

可以尝试在最后一步冰浴后加上适量的培养基（不含抗性），然后培养1小时以后再铺板，可以让阳性菌落先增殖，增高阳性率。

qumm1985[使用道具]
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发表于 2014-1-8 16:57 资料个人空间短消息加为好友

小中大

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原帖由 kswl870 于 2014-1-8 16:56 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

可以尝试在最后一步冰浴后加上适量的培养基（不含抗性），然后培养1小时以后再铺板，可以让阳性菌落先增殖，增高阳性率。

我就是热击后，冰浴2min，加800微升lb，1h铺板啊。

JK.jon[使用道具]
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发表于 2014-1-8 16:57 资料个人空间短消息加为好友

小中大

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原帖由 qumm1985 于 2014-1-8 16:56 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

谢谢！
请问：1 挑选平板上的几个菌落在一毫升lb中培养多长时间，再转接。
2 平板上的菌在4度放几天还能用吗？

你挑单菌落到3ml LB(尽量别用1 ml L后，37℃下，摇床上培养12-16小时.再以1%的比例转接到新的培养基（按你做的量斟酌，如10，100，200ml等体积）中，37℃下，在摇床上培养2小时。这里“1%的比例”，就是指你转接后体系体积的1%。如，你要转接到100ml LB中，那么就接入1ml的菌液。
平板上的菌在4度放几天肯定还能用，但前提是你得保证初始划线及培养没有污染！
祝你好运！

qumm1985[使用道具]
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发表于 2014-1-8 16:58 资料个人空间短消息加为好友

小中大

前天我又做了一次，
没加质粒的，50ug/mlAMP平板上长了一个菌落（A菌落）；
两个加质粒的，一个长了十几个（B菌落），一个二十几个。
我把B菌落在AMP培养液培养了一夜（C），A菌落在无AMP中速混匀1h（D），C和D各100uml铺平板（100ug/mlAMP），隔夜都长出一层菌。
这是为什么？原菌突变有抗性了？

8s5g[使用道具]
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发表于 2014-1-8 16:58 资料个人空间短消息加为好友

小中大

前天我又做了一次，
没加质粒的，50ug/mlAMP平板上长了一个菌落（A菌落）；

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污染

8s5g[使用道具]
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发表于 2014-1-8 16:59 资料个人空间短消息加为好友

小中大

两个加质粒的，一个长了十几个（B菌落），一个二十几个。

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不知道铺板用了多少ul菌液，如果200ul的话，那就表明感受效率低了。

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