蛋白质与蛋白组学 » 讨论区 » 经验共享 » 【求助】GST融合蛋白诱导

采购询价

点击提交代表您同意 《用户服务协议》 《隐私政策》

 
需要登录并加入本群才可以回复和发新贴

标题:【求助】GST融合蛋白诱导

plaa[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 77350
精华 0
积分 464
帖子 588
信誉分 100
可用分 3778
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-11-16
状态 离线
11
 
大家好。最近我做GST融合蛋白,做了几次表达不出来。
我的目的蛋白36K。连接的重组体已经测序,测序结果没有问题,也已经融合上。 可是,30度,用IPTG1mM诱导4小时,从SDS-PAGE结果看,只发现对照组有GST蛋白表达,重组质粒没有表达出目的融合蛋白。
希望各位高手指点下!!

==========================================================================================================

仅仅从SDS-PAGE就能判断你的融合蛋白没有表达?这个结论也下得太容易了,要知道,不是所有蛋白都能表达出一坨坨的。。。对照组仅仅是GST,所以表达量相对较高而已。为何不尝试亲和纯化后再跑电泳或者Western blot检测?
ps. 可以对融合基因进行测序,但是载体就不必测序了,劳民伤财,没有一点意义。
顶部
mimili_901[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 73543
精华 0
积分 564
帖子 723
信誉分 102
可用分 4458
专家分 20
阅读权限 255
注册 2011-9-24
状态 离线
12
 
请检查一下ORF!
顶部
zhezhe[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 72891
精华 1
积分 610
帖子 856
信誉分 102
可用分 5088
专家分 10
阅读权限 255
注册 2011-9-15
状态 离线
13
 

Rosetta (DE3)菌株不错可以试一下,不行的话,做一下密码子优化吧!
顶部
04906[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 73544
精华 0
积分 599
帖子 858
信誉分 100
可用分 5155
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-9-24
状态 离线
14
 

为什么选择30度呢?
顶部
guagua[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 72040
精华 2
积分 732
帖子 1016
信誉分 104
可用分 5955
专家分 20
阅读权限 255
注册 2011-9-3
状态 离线
15
 
目的基因mRNA的二级结构怎样、有没有稀有密码子、目的蛋白有没有毒性这都是值得考虑到问题。据说Rosetta (DE3)针对后者还不错,但表达量不会太高,PGEX-4T-2我一个师兄用DH5a也能表达。总之,多试试吧,我们对蛋白表达还知之甚少,运气也有很大成分。祝好运!
顶部
guagua[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 72040
精华 2
积分 732
帖子 1016
信誉分 104
可用分 5955
专家分 20
阅读权限 255
注册 2011-9-3
状态 离线
16
 
大家好。最近我做GST融合蛋白,做了几次表达不出来。
我的目的蛋白36K。连接的重组体已经测序,测序结果没有问题,也已经融合上。 可是,30度,用IPTG1mM诱导4小时,从SDS-PAGE结果看,只发现对照组有GST蛋白表达,重组质粒没有表达出目的融合蛋白。
希望各位高手指点下!!

==================================================

我觉得可以更换下诱导温度,不同蛋白的最佳诱导温度是不一样的。
顶部
guagua[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 72040
精华 2
积分 732
帖子 1016
信誉分 104
可用分 5955
专家分 20
阅读权限 255
注册 2011-9-3
状态 离线
17
 

另外,你跑胶用的样是上清中的蛋白吗,有时候蛋白在包涵体中,不妨用点沉淀中的样试试~~
顶部
jrwyyplt[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 79380
精华 1
积分 406
帖子 488
信誉分 102
可用分 3193
专家分 10
阅读权限 255
注册 2011-12-10
状态 离线
18
 


QUOTE:
原帖由 guagua 于 2014-1-9 11:09 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

另外,你跑胶用的样是上清中的蛋白吗,有时候蛋白在包涵体中,不妨用点沉淀中的样试试~~

我是用SDS上样缓冲液变性后,跑的电泳啊
包涵体也会裂解的
顶部
yueban-1147[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 75776
精华 0
积分 692
帖子 1064
信誉分 100
可用分 6113
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-10-27
状态 离线
19
 

不知道你是否预测了信号肽,如果你目的序列带有信号肽可能会导致无法表达,可以到预测信号肽的网站预测一下!cuturl('http://ptai.bioon.cn/user2/11798/archives/2006/74074.shtml')
顶部
jrwyyplt[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 79380
精华 1
积分 406
帖子 488
信誉分 102
可用分 3193
专家分 10
阅读权限 255
注册 2011-12-10
状态 离线
20
 


QUOTE:
原帖由 yueban-1147 于 2014-1-9 11:23 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

不知道你是否预测了信号肽,如果你目的序列带有信号肽可能会导致无法表达,可以到预测信号肽的网站预测一下!cuturl('http://ptai.bioon.cn/user2/11798/archives/2006/74074.shtml') ...

>Sequence
Prediction: Signal peptide
Signal peptide probability: 0.771
Signal anchor probability: 0.125
Max cleavage site probability: 0.241 between pos. 22 and 23
是不是挺高啊?
顶部