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标题:【求助】我如何来分离纯化我的昆虫细胞表达产物？

am10[使用道具]
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发表于 2014-1-9 16:29 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

分泌到细胞培养基中需要加信号肽
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紫烟[使用道具]
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发表于 2014-1-9 16:29 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

回复 #11 am10 的帖子

你好！我的序列预测是存在信号肽序列的。
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hot_hot_hot[使用道具]
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发表于 2014-1-9 16:30 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
pFastBac™HT B载体应该是不分泌的,所以应该是不会分泌到细胞培养基中,细胞培养基中的检测到蛋白,可能是因为有细胞破裂了.
Bac-TO-Bac系统一般都是用细胞裂解物纯化的.

======================================================================================================

相关疾病：
感染
我一般是细胞感染后收集细胞，然后用加Buffer，超声破碎，取上清纯化
我的细胞培养基中没有蛋白的；
强烈建议LZ做个小实验，确定感染天数，观察细胞情况，一旦出现破裂就说明细胞已经感染，然后收细胞，做SDS-PAGE、western-blot检测
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紫烟[使用道具]
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发表于 2014-1-9 16:30 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
相关疾病：
感染
楼上的意思是说以培养上清中出现目的蛋白为提示信号，确定细胞破碎的时间，最终还是从感染细胞中获得目的蛋白，对吗？
我的蛋白有信号肽序列，是可能分泌至培养上清中的，请问上清中的目的蛋白如何来获取呢？
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yhz1973[使用道具]
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发表于 2014-1-9 16:31 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

有组氨酸标签就用镍亲和层析柱纯化.要注意PBS浓度.昆虫细胞裂解液用过柱的PBS即可.超声裂解至清亮.离心,上清可过柱.培养上清需要超离心30万G,6-8小时,弃上清,然后用PBS重悬.注意所有过柱前先用滤膜过滤以防堵赛柱体.
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hot_hot_hot[使用道具]
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发表于 2014-1-9 16:32 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


QUOTE:
原帖由 紫烟 于 2014-1-9 16:30 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
相关疾病：
感染
楼上的意思是说以培养上清中出现目的蛋白为提示信号，确定细胞破碎的时间，最终还是从感染细胞中获得目的蛋白，对吗？
我的蛋白有信号肽序列，是可能分泌至培养上清中的，请问上清中的目的蛋白如何来获取呢？ ...


昆虫细胞表达蛋白，本省量就很少，如果要收集上清的话（也就是培养基），纯化到蛋白的可能性是0
所以我建议你让你的目的蛋白表达在细胞里，收集细胞，然后破碎细胞，取细胞的裂解液纯化，这样得到的量应该会多很多
这个方法我一直在用
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hot_hot_hot[使用道具]
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发表于 2014-1-9 16:33 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
向楼主求点东西，不知道楼主有没有
1、pFastBac载体
2、DH10Bac菌种
楼主如果有，不知能否给点？交易也可以的
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89tongzijun[使用道具]
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发表于 2014-1-9 16:34 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我是直接用液氮冻融三次，想使细胞破碎然后释放出蛋白，再纯化，可以吗？谢谢大家
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发表于 2014-1-9 16:34 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


QUOTE:
原帖由 89tongzijun 于 2014-1-9 16:34 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

我是直接用液氮冻融三次，想使细胞破碎然后释放出蛋白，再纯化，可以吗？谢谢大家


我觉得反复冻溶液可以破碎细胞，但是还要把核酸打碎的（超声）。
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发表于 2014-1-9 16:35 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我们这里就直接用NP40或者1XSDS裂解细胞，其实离心都不用亚。。然后就做WB检测你的蛋白有没有表达。。
一般来说，SF细胞里面表达的蛋白都 可以获得正常的折叠和可溶性。除了多糖等修饰不一样外，其他的都应该正常。
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