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标题:【求助】聚酮合酶(PKS)基因簇的研究:方案是否可行?

Ao7[使用道具]
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个人非权威看法。
把几个PKS进行组合的产生“天然的非天然”产物的概念在大约10年前就已经提出来了,这个概念本身在提出的时候是非常有创意的,而且在红霉素中已经通过实验证实了其可能性。在这个前提下,现在如果盲目的把不同基因簇的结构域进行组合,从学术意义上来说,和把青椒炒蛋换成红椒炒蛋相差不远,基本没有提供什么新的知识。
如果是从实际应用出发,以大规模制备天然产物库,筛选新型抗生素为目的,那么还算说的过去。但是如果没有制药公司的参与,我高度怀疑99%(国内和国外)的大学实验室具备这种能力。
在我看来可以研究的
1)如果克隆的基因簇指导合成的抗生素中具有新的化学结构,阐明负责这些新结构的的结构域,这个显然是具有创新性的;
2)对基因簇中特定的结构域进行目的明确定向改造,通过增加,删除或者修饰特定基团来改善抗生素性质,这个也在一定程度上提供了新知识,
3)鉴定新的抗生素产生菌,扩增抗生素来源库,这个的重要程度取决于你这个新抗生素的应用前景。
我个人认为这些比没有什么特定目标的进行“组合”要更有意义。
此外提醒一下LZ,如果希望通过文库质粒进行异源表达,那么使用承载能力大概50多KB的fosmid文库来克隆50KB的完整基因簇是非常困难的。为了保证能拿到完整的基因簇,文库中包括的克隆可能会是一个天文数字。
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koook5695[使用道具]
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的确如你们所说,不论是异源表达还是组合生物合成都不是新的概念,而且操作起来非常有难度。
楼上提到“鉴定新的抗生素产生菌,扩增抗生素来源库,这个的重要程度取决于你这个新抗生素的应用前景”,我想问一下这个是不是可以通过异源表达来实现?(我所要研究的目的抗生素macrolactin本来是来源于芽孢杆菌,我们准备在大肠杆菌中得到它)
另外,楼上提到“使用承载能力大概50多KB的fosmid文库来克隆50KB的完整基因簇是非常困难的”,在这里,我们设计了3个探针(详见我在八楼发的贴),希望通过它们找到整个基因簇的部分片段,最后再把这些片段通过生物信息学的方法做个理论上的拼接,不知是否可行?如果这样做还是不行,那么用您之前提过的BAC文库能否好一些?
多谢指教!
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Ao7[使用道具]
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我个人倾向于认为大肠杆菌应该不是抗生素基因簇表达的良好宿主,原核生物基因表达调控中重要的因子是sigma因子,芽孢杆菌和大肠杆菌在这方面的差别比较大,因此就这个问题而言,苏云金芽孢杆菌和链霉菌可能具有一定优势。此外要考虑的问题是,宿主本身是否对该抗生素敏感,要是对抗生素敏感,显然你是不可能克隆和表达成功的。
你应该可以通过这些调到阳性克隆,然后通过酶谱结合测序拼接出完整的基因序列,问题是,如果你用fosmid作为载体,在一个文库克隆上包含完整的基因簇的可能性太小,而这么大的片段,你后面不大可能把分别位于两个文库质粒上的基因簇部分克隆到同一个载体上进行异源表达,所以我觉得用BAC克隆80~100KB的片段应该更加可行。
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koook5695[使用道具]
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我觉得楼上说的很有道理,其实我们也在考虑用链霉菌作为表达宿主,Hopwood教授领导的小组构建的S. coelicolor CH999/ pRM5宿主/载体系统应用最为广泛。为降低S. coelicolor聚酮背景,通过同源重组将内源存在的放线紫红素生物合成基因簇整个缺失,仅保留了基因簇最左端的act VI-ORFA,并插入了红霉素抗性基因,这个宿主菌可接纳一系列携带PKS基因组合的质粒。CH999/pRM5宿主/载体系统表达了很多包括6-dEB在内的I型和II型聚酮,为聚酮的生产研究做出了价值无法衡量的贡献。
我打算先摸索着做一下,希望您以后多多指教!
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birdfish[使用道具]
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3年做完表达基本是不可能的,先把基因的序列测出来再考虑其他比较合适
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koook5695[使用道具]
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楼上言之有理,我最近也已开始了相关试验,基本是按照3.25帖中的方案进行,虽然不知道是什么结果,但是还是想尝试一下。
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