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标题:【求助】蛋白诱导

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【求助】蛋白诱导


我在做蛋白诱导,载体是pET32a,目前诱导温度是37度,IPTG最大浓度到5mmol/L,但是诱导结果不太理想,主要是量比较小,请问大家,IPTG可不可以加大浓度呢?它的作用原理是什么呢?谢谢大家回复啊
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yueban-1147[使用道具]
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晕,5M浓度已经很高了啊,高浓度IPTG对菌生长是有影响的。
建议降低IPTG浓度,适当降低诱导温度,延长诱导时间。
至于原理,记得好像是IPTG可以解除阻遏蛋白的功能,从而诱导转录开始。
你可以去网上查下专业的解释。
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谢谢啊,我的IPTG终浓度是5mmol/L,这个浓度也很大吗?实验室有的人告诉我要加到终浓度2mol/L呢,我没敢加,我今天再试一试别的温度。
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yueban-1147[使用道具]
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晕哦!怎么可能!我们的储备液才是1M的,2M怕是都难融!
严重鄙视如此不负责人的人!
你从1mM或500uM往下试。应该没问题。
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我今天做了0.2mM,0.5mM,1.0mM的,看看今天结果怎样
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我们都用0.5mM的,2M还能诱导吗,细菌都被杀死了,IPTG有毒性的.
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IPTG诱导蛋白表达的话,一般有下面几个问题:
1.诱导时机,也就是诱导的菌浓。诱导越晚,菌量越大,容易获得高密度;但相对菌体越老,表达蛋白的时间下降,表达量就可能下降。而诱导得早则菌体密度低,细菌从生长阶段进入表达阶段之后,生长减缓,虽然表达时间延长了,但由于总密度低而导致蛋白表达量不高。因此需要对你得菌以及蛋白做个分析,对诱导时机作出合理得选择。
2.诱导剂IPTG的浓度。IPTG的浓度与蛋白表达的速度相关(其本质应该是转录速度加快了吧?),高浓度表达快,低浓度表达慢。但是IPTG同时具有一定的细胞毒性,浓度越高,对细胞的活性越不利。另外,表达速度越快,蛋白越容易形成包含体。常用的浓度在0.1mM到1mM,也有更多或更少的。
3.诱导温度。一般来说,发酵都分为两个阶段即生长阶段和生产阶段。生长阶段用于菌体生长,一般取比较丰富得培养基和适宜的条件来获得最大的比生长速率;而生产阶段也就是诱导表达阶段,一般换做限制性培养基(E.coli一般不换),降低温度来延缓细菌的生长,延长蛋白表达的时间,从而增加外源蛋白质的表达。同时降低温度也可以在一定程度上减少包含体的形成,一般从30度到24度,最低也有18或16度的。
总得来说建议你降低IPTG浓度,同时降低诱导温度,两个条件都可以做一个梯度实验。同时延长一下表达时间。
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xue258[使用道具]
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请问楼主用的 表达菌是BL21么?如何检测蛋白的表达?是page电泳么,请问上样样品 是如何 处理的 啊 ?
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youyou99[使用道具]
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检测蛋白的表达,只需要将诱导的细菌直接加入loading buffer,高温煮沸裂解,同时做一管没有诱导的菌做阴性对照,裂解后的菌体离心,上清和沉淀分别SDS-PAGE检测,如果诱导成功就可以明显看到诱导后的细菌在目的蛋白处条带明显比对照粗
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我们实验室是将菌体12000转离心5分钟,弃上清,加入100ul Tirs-cl(pH6.8)重悬沉淀,再加入5*SDS loading buffer,煮沸10分钟,跑SDS page胶看蛋白表达量,同时做非诱导菌和空载体诱导与非诱导作对照。
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