蛋白质与蛋白组学 » 讨论区 » 经验共享 » 【求助】蛋白诱导

采购询价

点击提交代表您同意 《用户服务协议》 《隐私政策》

 
需要登录并加入本群才可以回复和发新贴

标题:【求助】蛋白诱导

@STAR@[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 74483
精华 0
积分 464
帖子 506
信誉分 101
可用分 3456
专家分 10
阅读权限 255
注册 2011-10-11
状态 离线
11
 
我觉的说的很有道理,我会按照你说的方法优化诱导条件
顶部
@STAR@[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 74483
精华 0
积分 464
帖子 506
信誉分 101
可用分 3456
专家分 10
阅读权限 255
注册 2011-10-11
状态 离线
12
 

今天我用1.0mM的IPTG诱导的,发现随着时间延长菌体没有明显的增多,是不是因为IPTG浓度大了,抑制菌体增殖呢?我是不是应该降低诱导剂浓度呢?还有我是在18度诱导的,是不是低温也会影响菌体增殖呢?
顶部
huifeng0516[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 76210
精华 0
积分 552
帖子 783
信誉分 100
可用分 4731
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-11-2
状态 离线
13
 

低温肯定降低细菌生长速率,而加入IPTG以后菌体生长也是必然会受到抑制。这一方面来自IPTG的细胞毒性,另一方面来自自身能量和物质的分配。诱导开始以后,在同样的比消耗速率下(也就是吸收相同的碳源氮源等等),要分出一大部分来生产外源蛋白,细菌还能利用多少营养来繁殖自己呢?所以“菌体没有明显增多”是正常的。
如果你做过生长曲线,特别是发酵的生长曲线,就会很清楚了。建议做一下,OD对time,或者湿重对时间作图。一般做发酵的,特别是发酵调控的话,这个是必须的。
关注两点。
一是你在什么时候加诱导剂。在OD的多少时候诱导,可以取决于你的蛋白对细胞有无毒性,是否会影响到细胞的增殖。
二是诱导多长时间。也就是下罐的时间,对于摇瓶来说就是收菌的时间,取决于你的细胞什么时候老化死掉,或者你的蛋白什么时候开始降解。因此需要对诱导之后每隔一段时间(比如1-2小时),取样,最后把所有的样品一起做SDS-PAGE,一般可以看出你的目标蛋白随着时间在增加,到某个时间达到最大,然后开始降解,从而优化你的发酵时间。
顶部
tangxin_80[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 79896
精华 0
积分 549
帖子 757
信誉分 100
可用分 4621
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-12-17
状态 离线
14
 

我在OD值0.5的时候加的诱导剂,37度诱导,从2.5小时开始取样,每隔1小时取一次样,共取了5个时间点的样,但是感觉 蛋白的量没有太大变化。我的IPTG是1mmol/L,是不是浓度大了?
顶部
pengke1983[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 78619
精华 0
积分 470
帖子 639
信誉分 100
可用分 3986
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-12-1
状态 离线
15
 
我在OD值0.5的时候加的诱导剂,37度诱导,从2.5小时开始取样,每隔1小时取一次样,共取了5个时间点的样,但是感觉 蛋白的量没有太大变化。我的IPTG是1mmol/L,是不是浓度大了?
不知道你用的是什么菌,37度温度太高了,试试30度与25度。IPTG的终浓度是由你构建的质粒载体决定,比如pet系统。
顶部
@STAR@[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 74483
精华 0
积分 464
帖子 506
信誉分 101
可用分 3456
专家分 10
阅读权限 255
注册 2011-10-11
状态 离线
16
 

我用的表达菌是BL21,载体是pET32a,刚开始我用37度诱导,IPTG是1mmol/L,诱导出来了,做western结果也正确,但是后来再按照这个条件做就做不出来了,不知道是什么原因。还有就是抗生素的浓度对表达有影响吗?
顶部
小郭郭郭郭郭[使用道具]
一级
Rank: 1


UID 449724
精华 0
积分 1
帖子 1
信誉分 0
可用分 5
专家分 0
阅读权限 255
注册 2023-7-21
状态 离线
17
 

回复 #16 @STAR@ 的帖子

我也是,第一次诱导出来了过表达很好,后来同样的条件就做不出来了,是哪里出了问题啊
顶部
chenzhen2016[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 440604
精华 0
积分 261
帖子 261
信誉分 0
可用分 1026
专家分 0
阅读权限 255
注册 2023-6-8
状态 离线
18
 
在蛋白质表达中,IPTG(异丙基硫代半乳糖苷)是一种常用的诱导剂。它的作用是激活负责转录目标基因的T7启动子,从而促使目标蛋白的表达。

IPTG的作用原理如下:

1. T7启动子:在pET32a载体中,负责转录目标基因的启动子是T7启动子。在没有IPTG存在时,T7 RNA聚合酶无法结合在T7启动子上,因而无法启动目标基因的转录。

2. IPTG的作用:当加入IPTG时,它能与T7 RNA聚合酶结合,形成IPTG-T7 RNA聚合酶复合物。这个复合物与T7启动子结合并激活转录,从而导致目标基因的mRNA合成。

3. 目标蛋白表达:mRNA进一步被翻译成目标蛋白,使其在细胞内表达。

关于增加IPTG浓度的问题:

在一般情况下,增加IPTG浓度可能会增加目标蛋白的表达水平。但是要注意,过高的IPTG浓度可能会导致细胞内的毒性效应,对细胞造成损伤,从而影响蛋白的表达。因此,建议进行一系列IPTG浓度的优化实验,找到适宜的IPTG浓度,以提高蛋白的表达量。

此外,蛋白表达的成功也与其他因素有关,比如诱导温度和诱导时间等。您可能需要调整这些参数以优化蛋白表达效率。

总结:IPTG是一种常用的蛋白表达诱导剂,通过激活T7启动子促进目标蛋白的表达。在使用IPTG时,建议进行浓度的优化实验,找到适宜的IPTG浓度,同时也需要考虑其他因素的影响,以提高蛋白表达量。
顶部
anxf999[使用道具]
二级
Rank: 2


UID 442528
精华 0
积分 85
帖子 10
信誉分 0
可用分 50
专家分 0
阅读权限 255
注册 2023-6-16
状态 离线
19
 

腾龙公司怎么开户(流程tl6609.com)

腾龙公司开户微信【v9788800】微同号【微信号qq788233】腾龙公司以实现诚信第一、服务致胜为经营宗旨,优质的服务团队为客人提供24小时全方位的星级服务!
顶部
anxf999[使用道具]
二级
Rank: 2


UID 442528
精华 0
积分 85
帖子 10
信誉分 0
可用分 50
专家分 0
阅读权限 255
注册 2023-6-16
状态 离线
20
 

华纳公司开户官网【363536.com】

华纳公司开户微信【v9788800】微同号【微信号qq788233】华纳公司以实现诚信第一、服务致胜为经营宗旨,优质的服务团队为客人提供24小时全方位的星级服务!


查看积分策略说明
附件
2023-7-25 12:25
Screenshot_20230313_143326_edit_340666408075617.jpg (74.87 KB)
 华纳公司开户微信【v9788800】微同号【微信号qq788233】华纳公司以实现诚信第一、服务致胜为经营宗旨,优质 ...
顶部