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标题:【求助】蛋白诱导

anxf999[使用道具]
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发表于 2023-8-8 14:42 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
蛋白质诱导是一种常用的方法，用于在大肠杆菌等表达系统中产生目标蛋白质。IPTG（异丙基β-D-硫代半乳糖苷）是一种人工合成的分子，用于诱导蛋白质表达。它通过模拟大肠杆菌中的内源性信号分子（如乳糖）来激活载体中的启动子，从而促使目标基因的转录和翻译。

在IPTG诱导中，通常的操作是将大肠杆菌细胞在感兴趣的生长阶段添加IPTG。IPTG的存在会激活载体中的lacUV5启动子，进而促使目标基因的表达。通常情况下，IPTG浓度为0.1-1 mM即可实现诱导效果。

但是，过高浓度的IPTG可能会导致一些问题。例如，高浓度的IPTG可能导致大肠杆菌细胞感受到毒性压力，从而影响细胞生长和表达。此外，高浓度的IPTG还可能导致目标蛋白质的不正常折叠或聚集，从而影响其产量和纯度。

如果你的诱导结果不理想，考虑以下几点可能有助于改善实验效果：

1. 时间点的选择： IPTG的添加时间点可能影响蛋白质表达。通常在细胞进入对数生长期后添加IPTG效果较好。

2. 浓度的优化： 尝试不同浓度的IPTG，通常0.1-1 mM范围内即可实现适当的诱导。

3. 温度的调整： 考虑尝试不同的诱导温度。有时，将温度降低至30°C或提高至42°C可能会改善表达效果。

4. 细胞菌株的选择： 不同的细胞菌株对IPTG的响应可能不同。尝试使用不同的细胞菌株也许能改善表达效果。

5. 考虑亲和标签： 将目标蛋白质与亲和标签（如His标签）融合，有助于提高目标蛋白质的产量和纯度。

6. 蛋白质的毒性和折叠： 如果目标蛋白质有毒性或易于错误折叠，适当的IPTG浓度和诱导时间可能需要调整，以减少对细胞的不良影响。

最重要的是，优化蛋白质表达是一个试错过程，需要综合考虑不同因素的影响。建议进行一系列的实验，根据实验结果逐步调整IPTG浓度和诱导条件，以获得最佳的蛋白质表达效果。
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发表于 2023-8-18 16:59 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
IPTG（异丙基-β-D-硫代半乳糖苷）是一种人工合成的化合物，用于诱导原核生物中的蛋白表达。它可以模拟天然的半乳糖诱导系统，激活载体中的T7或T5启动子，从而促使目标蛋白的表达。

IPTG的作用原理是通过结合重组表达载体上的启动子，释放出基因表达所需的蛋白质转录和翻译机器，从而实现目标蛋白的过量表达。IPTG在一定程度上模拟了细菌在自然环境中遇到半乳糖的情况，从而诱导目标基因的表达。

关于IPTG的浓度，通常5mmol/L是常用的浓度范围，但实际使用时可以根据具体的实验情况进行调整。如果你的诱导效果不理想，可以尝试以下几种方法：

1. 调整IPTG浓度： 尝试增加IPTG的浓度，但要注意过高的浓度可能会引起毒性或影响细菌的生长。适当地增加浓度后观察是否有改善。

2. 调整诱导时间： 有时候延长诱导时间可以提高蛋白表达量，但也要注意过长的诱导时间可能导致过量表达引起问题。

3. 调整诱导温度： 尝试在不同的温度下进行诱导，有时候降低诱导温度可以增加蛋白的溶解度和稳定性。

4. 优化培养基和生长条件： 确保培养基成分和生长条件适合目标蛋白的表达。一些蛋白可能需要特定的培养条件。

5. 使用不同的载体和宿主菌株： 不同的载体和菌株可能对蛋白表达有不同的影响，尝试不同的组合。

最终的诱导条件需要根据你的实验目的、菌株特性和蛋白性质进行优化。最好在实验过程中进行多次尝试和探索，结合实验结果进行调整。如果实验效果仍然不理想，也可以考虑寻求实验室同事或导师的意见。
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156****7008[使用道具]
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发表于 2023-9-23 18:44 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
想问下各位大佬，我的四个蛋白基因，有一个表达量很低，我试了一系列关于IPTG浓度，添加时的OD值，诱导时间，诱导温度。但是表达量仍然很低，想问下除了以上几个条件以外，还有哪些条件会影响蛋白的表达量啊？我用的也是pet28a的质粒，bl21的菌株。我另外三个有两个的表达量蛮高的，还有一个表达量也还行。
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