小中大对我的目前观点做个了结，算是告一段落，但还是希望这个帖子还会有活力。
1．磷酸化修饰也是引起isoform的一种，HSP27归属此类。
2．人HSP27根据等电点的不同（为磷酸化引起）分为HSP27A，HSP27 B, HSP27 C, HSP27D 4个异构体，未磷酸化的为HSP27A，占正常未诱导情况下的90％，PI约为6.8。有的因素可促进HSP27转录；有的因素刺激下HSP27A磷酸化后转变为HSP27 B、HSP27 C、HSP27D，HSP27总量不变，故为翻译后修饰。因伴有磷酸化并且比HSPA偏酸（至于后面3个异构体是不是仅由磷酸化引起而无其他因素参与，我没有查到专门的讨论，但根据资料考虑异构体就是磷酸化引起的。）不同因素处理HSP27磷酸化的位点个数也不同。
3．人HSP27有3个磷酸化位点均为丝氨酸，分别为Ser15, Ser78, and Ser82.我没有查到更多的磷酸化位点的报道，就这3个，3个都磷酸化总共增加0.24kd，可以引起分子量的改变，并在western上有所体现（～28kd＋0.24kd，接近0.9％的差异，也不小，这个分子量我估计要12％或以上的分离胶完全可以分离，15％左右的胶效果更好）。
4 对磷酸化导致的等电点改变有2种解释：这两种观点只有一种可能，但我没有查到支持任一观点的任何资料，请熟悉磷酸化的战友前来助阵。
a．1个磷酸化位点（无论哪一个）对应1个PI，则2D上有未磷酸化、1个磷酸化、2个磷酸化、3个磷酸化共4个点。不能解释2D上分子量完全一致（实际2D差几百个分子量还是看不出来的）及5个点（要不就是你发现除此3点之外新的位点？或者是Uuuuuuuu提出的突变？）。也不能解释western上2条带。（除非这样解释：以未磷酸化和n个磷酸化为主要，故其他几个磷酸化在western上没有显示）。
b．3个位点的磷酸化各对应1个PI，排列组合后，未磷酸化1个点，1磷酸化3个点，2磷酸化3个电，3磷酸化的1个点，2D上最多有8个点的可能（这种解释从道理上好像讲不通，不同位置的同一氨基酸加了同一磷酸根，怎么会PI不同呢？）。用某些磷酸化信号低2D及western不能显示就可以基本解释所有现象了。
5．蛋白质从N端开始标号，人HSP27编码199AA，磷酸化最大在Ser82，抗体识别C端，故磷酸化对抗体识别没有影响。尚需知道磷酸化后PI是变大还是变小。这个对解释也很重要。文献说HSP27 B, HSP27 C, , HSP27 D伴有磷酸化并且比HSPA偏酸，推测磷酸化后PI变小。
6．目前我尚未见有关HSP27糖基化的报道。
7．也未见有关AA序列变化（翻译前引起,比如PremRNA不同剪接方式）引起的异构体导致分子量差异及相关报道。
8．很多文献western上HSP27都有2条带的，所以还是考虑HSP27本身的因素引起的。当所有解释都无法行通时，尚不能排除因为抗体非特异性引起的western杂带（迫不得已再用此解释，或者用磷酸酶处理后看是否还有这个杂带也可明确，或者单抗的交叉会小一些）。
9．关于2D上的5个点。楼主一定至少做3个样本的2D予以验证。Uuuuuuuu提出的突变，也是思路之一。
10．提供几个的非常有价值的免费文献，我上面的分析主要也是参考这些文献（中文文献就不要再搜了，我搜过，没有搜到什么有价值的文章）。请楼主仔细阅读，注意文献中研究方法和结果解释，对本问题的解释及后续的实验设计很有帮助。楼主看完后还望对几位战友的讨论做个总结或提出自己的观点，时间不限，一两个星期以内都可以的，1个月后都可以，只要楼主的课题有所进展，我随时关注。也算是楼主对自己课题的负责。
a
J. Biol. Chem., Jan 1992; 267: 794 - 803.
Human HSP27 is phosphorylated at serines 78 and 82 by heat shock and mitogen-activated kinases that recognize the same amino acid motif as S6 kinase II
b
J. Biol. Chem., Vol. 262, Issue 32, 15359-15369, Nov, 1987
Characterization and purification of the small 28,000-dalton mammalian heat shock protein
c
J. Biol. Chem., Aug 1991; 266: 14721 - 14724.
Identification of the Phosphorylation Sites of the Murine Small Heat Shock Protein hsp25
d
非免费的（摘要免费）
J Cell Physiol, Apr 1991; 147(1): 93-101.
Phosphorylation of HSP27 during development and decay of thermotolerance in Chinese hamster cells.
最后感谢色谱老前辈百忙之中前来助阵，我也觉得western图上不是降解的表现（见我帖链接 cuturl('http://www.dxy.cn/bbs/thread/6005760') ）。色谱前辈的观点也增强了我对翻译后修饰的认同。
站友的课题正好与此问题类似，分析的也很独到，欢迎常来蛋白版讨论。
楼上说的切胶后做后面的那些实验（我看不明白几个缩写的），与质谱的思路是类似的。
楼上说的glycerol-urea electrophoresis（甘油尿素电泳？），也是解决办法之一。
