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标题:【求助】电转化毕赤酵母GS115后PCR验证不对

shenkunjie[使用道具]
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发表于 2014-2-13 10:19 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】电转化毕赤酵母GS115后PCR验证不对


我现在做酵母表达，我所要表达的蛋白来源于酿酒酵母，理论上不应该对毕赤酵母产生毒性，应该可以在GS115中表达。我用ｐPIC9K的质粒，连接上以后测序结果正确，用自己的引物PCR反应后可以得到大小正确的条带，但是诱导后没有表达。后来我用5‘AOX于3’AOX的引物扩增，所得到的条带于表达手册上给的标准不一致，我找不到原因，望前辈指教。


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2014-2-13 10:19
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shenkunjie[使用道具]
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发表于 2014-2-13 10:23 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

如上图，1－5是电转后挑的克隆，９ｋ是空质粒转化后的克隆，marker依次是5bp，3bp，2bp，1bp，750bp，500bp,空质粒倒是可以得到一条正确的条带，但是其他克隆却不对。我的基因片段是900bp。拜请前辈们指教
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shenkunjie[使用道具]
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发表于 2014-2-13 10:24 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

对了，我用的Sal I 做的线性化
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c86v[使用道具]
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发表于 2014-2-13 10:29 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

如果是那个较亮的主带,应该大小是对的吧,500+900
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shenkunjie[使用道具]
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发表于 2014-2-13 10:29 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

谢谢楼上的回复，可为什么还会扩出下面的大约500bp的条带呢，这让我百思不得其解
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bamboo16[使用道具]
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发表于 2014-2-13 10:29 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我也遇到与你同样的问题。不解。
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shenkunjie[使用道具]
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发表于 2014-2-13 10:30 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
你有试过重新转化吗？
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junjie05[使用道具]
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发表于 2014-2-13 10:31 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

记得一篇综述上提过，酵母诱导的重组有三种形式，其中除了双交换重组外，存在两种插入重组。而插入重组中有一种是插入到了AOX1以外的地方（具体的位点忘记了……）
很可能你的这几个都是这样的情况。这种情况下，使用通用引物进行PCR会同时出现这两条带，但是甲醇诱导却起不到明显效果。
我真正感兴趣的倒是另外的两条1kb和2kb，3号样品尤为明显。这两个是怎么来的，难不成质粒中联入了多个500bp？？还望高手解答～
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junjie05[使用道具]
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发表于 2014-2-13 10:31 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

对了，忘记说，这种插入的情况下，MD和MM平板上的长势基本上是没有区别的。
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duoduo[使用道具]
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发表于 2014-2-13 10:31 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

可问题是我在MD和MM平板上验证过，有很明显的区别。28度培养两天，在MM平板上基本不张，但在MD上长得很好。我也搞不清楚这是怎么回事
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