【求助】电转化毕赤酵母GS115后PCR验证不对 - 经验共享

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标题:【求助】电转化毕赤酵母GS115后PCR验证不对

小游abc[使用道具]
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发表于 2014-2-13 10:35 资料个人空间短消息加为好友

小中大

你可以试试一条用5‘AOX1一条是你自己目的基因的特异性引物批一下，这样可以鉴定非定向克隆。这样应该就能比较准确的鉴定出是否将目的基因转进去了。

阿凡提[使用道具]
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发表于 2014-2-13 10:36 资料个人空间短消息加为好友

小中大

你有试过重新转化吗？

==============================

还没呢，我打算挑几个先诱导看看

shenkunjie[使用道具]
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发表于 2014-2-13 10:36 资料个人空间短消息加为好友

小中大

你验证后如果有表达的话能否请你告诉我一声，我做个参考，不胜感激。

shenkunjie[使用道具]
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发表于 2014-2-13 10:37 资料个人空间短消息加为好友

小中大

多谢指点，我先试试，有结果了再请教你。所以这个贴烦你再关注几天，我有结果就发上来。非常感谢。

喵咪[使用道具]
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发表于 2014-2-13 10:37 资料个人空间短消息加为好友

小中大

记得一篇综述上提过，酵母诱导的重组有三种形式，其中除了双交换重组外，存在两种插入重组。而插入重组中有一种是插入到了AOX1以外的地方（具体的位点忘记了……）
很可能你的这几个都是这样的情况。这种情况下，使用通用引物进行PCR会同时出现这两条带，但是甲醇诱导却起不到明显效果。
我真正感兴趣的倒是另外的两条1kb和2kb，3号样品尤为明显。这两个是怎么来的，难不成质粒中联入了多个500bp？？还望高手解答～

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酵母诱导的三种重组方式：
Bgl 2 for replacement at AOX1
Sac I for insertion at AOX1
Sal I for insertion at His4
我采用的是Sac I 酶切，理论上应该产生AOX1 位点的insertion，不是吗？

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发表于 2014-2-13 10:39 资料个人空间短消息加为好友

小中大

我昨天挑了clone于BMGY中培养，明天可以开始诱导，诱导要4，5天，估计要下周出结果。无论如何，我到时会给个结果上来。同时，我打算要把从别处获得的positive control也来尝试进行一次转化表达，考虑用三种酶分别切。

shenkunjie[使用道具]
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发表于 2014-2-13 10:39 资料个人空间短消息加为好友

小中大

酵母诱导的三种重组方式：
Bgl 2 for replacement at AOX1
Sac I for insertion at AOX1
Sal I for insertion at His4
我采用的是Sac I 酶切，理论上应该产生AOX1 位点的insertion，不是吗？
理论上是这样的，我用SａｌI 进行线性话，但是结果也是跟理论不符，所以我才纳闷是否是我中途某个实验过程错了，还是这种不符合的情况也是实验范围内允许的。我现在也在重新诱导，差不多也要4到5天后出结果。到时我也把我的结果传上来，大家一起参考吧

shenkunjie[使用道具]
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发表于 2014-2-13 10:39 资料个人空间短消息加为好友

小中大

我的结果出来啦，我诱导了四天，因为第四天检测到有杆菌污染，我就没有接着诱导了。
跑交结果很奇怪，基本上就没有条带，对照和样品都一样，只有沉淀里有很多条带，但对照和样品没有很明显的差别。

shenkunjie[使用道具]
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发表于 2014-2-13 10:40 资料个人空间短消息加为好友

小中大

1234泳道为上清，5678泳道为沉淀。其中1357是对照。

喵咪[使用道具]
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发表于 2014-2-13 10:40 资料个人空间短消息加为好友

小中大

我的western结果也出来了，是个白板。
我采用3ml OD=5左右的菌诱导表达，72h取100ul培养物离心得约80ul培养基上清，最终上样20ul。
不过，我将膜用立春红染色后，发现上清蛋白量非常非常少，今天考虑收样后浓缩再跑胶western

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