蛋白质与蛋白组学 » 讨论区 » 经验共享 » 【求助】电转化毕赤酵母GS115后PCR验证不对

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标题:【求助】电转化毕赤酵母GS115后PCR验证不对

shenkunjie[使用道具]
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发表于 2014-2-13 10:41 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
你可以试试一条用5‘AOX1一条是你自己目的基因的特异性引物批一下，这样可以鉴定非定向克隆。这样应该就能比较准确的鉴定出是否将目的基因转进去了。

===================================================================================================

我扩了，但是扩不出来。我用但向的５‘AOX的引物也扩不出来。这是不是说明没插入啊。可是我自己的引物为什么可以扩得出来呢
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喵咪[使用道具]
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发表于 2014-2-13 10:41 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


QUOTE:
原帖由 shenkunjie 于 2014-2-13 10:41 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
你可以试试一条用5‘AOX1一条是你自己目的基因的特异性引物批一下，这样可以鉴定非定向克隆。这样应该就能比较准确的鉴定出是否将目的基因转进去了。

============================================================= ...

我想请教你是如何将收到的培养基上清用于电泳上样的？
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shenkunjie[使用道具]
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发表于 2014-2-13 10:42 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


QUOTE:
原帖由 喵咪 于 2014-2-13 10:41 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')


我想请教你是如何将收到的培养基上清用于电泳上样的？

请教不敢当，我也是问题多多，大家一起讨论讨论。
我一般取2 ml样品，离心后上清用TCA沉淀浓缩，加loading buffer煮过之后，就按一般的方法进行SDS－ｐａｇｅ
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xingyi08[使用道具]
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发表于 2014-2-13 10:42 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

结果正确啊，
目的基因插入5‘AOX引物后的区域，
PCR结果就是
目的基因长度+（5'AOX引物处~目的基因插入位点的片段长度）约500bp
即900bp+500bp=1400bp左右
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shenkunjie[使用道具]
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发表于 2014-2-13 10:42 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


QUOTE:
原帖由 xingyi08 于 2014-2-13 10:42 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

结果正确啊，
目的基因插入5‘AOX引物后的区域，
PCR结果就是
目的基因长度+（5'AOX引物处~目的基因插入位点的片段长度）约500bp
即900bp+500bp=1400bp左右 ...

可是下面好像多一条500bp的条带啊，而且没有操作手册上说的2.2kb的那条带
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发表于 2017-11-27 10:59 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
请问各位的问题解决了吗？我也遇到同样的问题
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199****3828[使用道具]
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发表于 2024-3-17 19:57 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

转化后如何PCR验证

楼主你好，我有个问题想请教以下，将目的基因转化到毕赤酵母GS115基因之中后，需要用PCR验证是否转化成功，进行PCR时如何设计引物？是个什么样的思路？万分感谢
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