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标题:【求助】蛋白纯化后反相上目标峰貌似由两个峰组成

dragonkilly[使用道具]
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具体文献找不着了,不过文献上看过,在一个conference上也听人报告过。
我觉得比如glycolylation这种修饰,如果程度够大而且改变表面电荷的话,应该可以分离的。但如果位点很少,而且包埋起来了的话当然更困难。
有成功的例子不代表就一定适应您的蛋白。
analytical gel filtration,跟一般SEC是一样的,只是可以分析很少量的样品,如果有autosampler的话,把peak的不同fraction跑一遍,看profile是不是有变化,是不是规律,就知道是不是两种形式的蛋白了。不知道结合质谱能不能要到你想要的结果,没做过。请有经验的战友继续。
楼上战友的建议很不错,同样您可以分析一下潜在的其他修饰位点。
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dragonkilly[使用道具]
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根据楼上提供的糖基化位点比对我的蛋白序列,没有找到相应的位点,应该还有其它形式的糖基化位点,我再试着找找。另外,我们觉得要真的是糖基化了的话也可能是修饰位点少(我们样品过了离交,疏水等几步层析,修饰位点多的话应该能分离的),判断是否糖基化除了用酶切外,我们还想用ConA亲和层析试试看,据说这个对糖基化比较灵敏。
SEC今天我们就准备试试看,结果出来再跟大家讨论。
另外,还有个问题,就是跑反相不同厂家的乙腈对保留时间等影响大吗?下图是两批不同乙腈跑上述样品的结果,峰型变化有点大的说(最后一个是加了4.5M的盐酸胍)


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seagate[使用道具]
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是异构体或者有轻微降解
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ii077345[使用道具]
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用等电距焦能检测出来,分离上可采用精确的PH变来实现
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