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标题:【求助】 6X His标签蛋白的纯化求助

zhenxin[使用道具]
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发表于 2014-2-22 17:53 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

柱子在华美，透析代在鼎国
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发表于 2014-2-22 17:54 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
那看你选择什么除盐的方法,透析要留意是不是有沉淀,蛋白通常需要有点离子强度才好溶解,不能都去掉盐.如果是过柱子要留意柱子有时候盐浓度低会有非特异吸附,所以也需要点离子浓度。
我现在也在做纯化，用NI-NTA纯化一个酶蛋白，纯化前有活性，过柱后活性就消失了，经过做对照得知，是因为咪唑浓度过高（250mM），我现在用Sephadex G-25脱盐，平衡缓冲液用PBS可以吗，还有我的蛋白中有4对二硫键，请问用再加点什么吗？
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发表于 2014-2-22 17:55 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
那看你选择什么除盐的方法,透析要留意是不是有沉淀,蛋白通常需要有点离子强度才好溶解,不能都去掉盐.如果是过柱子要留意柱子有时候盐浓度低会有非特异吸附,所以也需要点离子浓度。
我现在也在做纯化，用NI-NTA纯化一个酶蛋白，纯化前有活性，过柱后活性就消失了，经过做对照得知，是因为咪唑浓度过高（250mM），我现在用Sephadex G-25脱盐，平衡缓冲液用PBS可以吗，还有我的蛋白中有4对二硫键，请问用再加点什么吗？
......

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可以先不加，也许是咪唑干扰，纯化完马上除盐试试．
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发表于 2014-2-22 17:55 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
可以先不加，也许是咪唑干扰，纯化完马上除盐试试．
非常谢谢，我试试。
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mingming0638[使用道具]
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发表于 2014-2-22 17:56 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

“纯化前有活性，过柱后活性就消失了，”
看来纯化还是需要不断摸索条件的，别看步骤就那么几步，但是要保证最大限度的留住目的蛋白，还是需要优化下条件和一定的运气的。
我的NI-NTA琼脂糖明天就要到了，这两天就要开始纯化试验。
我会将心得体会一一及时上报各位战友。
楼上战友提醒了我，
刚刚从鼎国订购了透析袋，长度都是5M的，我买了宽度是36的，但是对于透析袋的作用原理，不是很清楚，万一把目的蛋白都给透析掉了，那真是得不偿失了！！！
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发表于 2014-2-22 17:56 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

透析代使用也是有很多学问的，我也是刚看了些之方面的书，如透析代一定要煮好，且洗干净.之后装蛋白不能太多，里边不要有气泡.夹子一定要夹紧.一次用的透析代不要太长，呵呵，都是自已总结来的.虽说只做了三次纯化，准备明天再做一次，我现在蛋白纯化的挺好的，就是有一个问题好象是蛋白变性的问题，所以想用一个月的时间来解决之，看着有这么多站友奋斗在蛋白的一线上，明天一定要开开心心的做实验了.纯化过程中有什么经验一定要及时的上报啊.让大家一起为蛋白而战吧.
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shenkunjie[使用道具]
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发表于 2014-2-22 17:57 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

纯化后马上除盐方法能不能先用纯水透析，然后透上一个小时再换到相应的透析液中，这样是不是能快点将高浓度的咪唑去丢的快一些，而且还会保持蛋白的活性
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发表于 2014-2-22 17:57 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

蛋白变性的问题貌似很常见呀，晕了，
楼主说要用cocktail 来保护蛋白，这一步是否不可缺少呢？？？
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mingming0638[使用道具]
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发表于 2014-2-22 17:58 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

protease inhibtor cocktai不能随便使用，应该根据下游的实验需要决定使用不同的蛋白酶抑制剂。在直接westernblot的时候使用没有什么顾忌，但在后期涉及纯化，酶切或者某些活性检测的时候，cocktail中的某些抑制剂会干扰下游的实验。
:【求助】蛋白质组学中用何种蛋白酶抑制剂较合适？
摘自panmo2006战友对上述求助帖的回答。所以我打算用PMSF来替代cocktail
我昨天做了第一次纯化，洗脱液有杂带，目的条带不清，无法判断有或无。
打算从以下方面改进：
第一，就是添加终浓度为1mM的PMSF（另一种蛋白酶抑制剂），但是查了很多地方，发现要用异丙醇溶解的，对此，我很担心异丙醇的引入会否影响6XHIS-Tagged蛋白的产量？虽然操作手册上写明少量乙醇或甘油等醇类是不影响纯化的，但是难保异丙醇不会啊！！！
第二，由于6X HIS蛋白与Resin有很强的亲和力，宜用较多的上样量，这样只有极少的杂蛋白结合到Resin上，相反，如果用太多的Ni-NTA Resin，加上binding,washing等操作条件不够严谨（stringent）的话，杂蛋白就有机会结合上去，造成污染.
第三，始终在4度下进行操作。
第四，所有的缓冲液要提供足够的离子强度，例如添加较多的NaCl.
第五，咪唑的作用在于和6X HIS蛋白的组氨酸残基竞争镍离子，因此binding buffer、wash buffer以及ELUTE BUFFER中多试几个咪唑的浓度梯度有利于掌握最佳的咪唑浓度。
第六，在wash resin的过程中通过添加0.1-1%的Triton X-100等detergent来洗去杂蛋白。
摸索条件果然辛苦啊：（（（
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mingming0638[使用道具]
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发表于 2014-2-22 17:59 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

相关疾病：
头痛
现在碰到了非常头疼的事情。
SDS-PAGE电泳时，纯化好后的蛋白没有经过透析直接上样，结果还没跑完浓缩胶，就见溴酚蓝参差不齐，东倒西歪，另外，浓缩不成一条直线。简直可以用大花脸来形容，图我就不上了，情况就是这样的。
我唯一能确定的是所制的浓缩胶是没有问题的，其他的线索就是：我的蛋白样品中含有PMSF（用乙醇溶解），较多的氯化钠，一定量的2-ME以及NP-40，说到NP-40，我昨晚纯化的时候，发现树脂结块现象，我估计是NP-40捣的鬼。
做了一个通宵的实验，身心俱疲啊！如果是蛋白电泳正常跑完后，发现纯化结果不好，我也就算了，可以重新摸索纯化条件，可现在连蛋白电泳都不能正常去跑，实在让我失落啊。请战友们指点迷津！
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