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标题:【求助】 6X His标签蛋白的纯化求助

wood533[使用道具]
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发表于 2014-2-22 18:00 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
可以先不加，也许是咪唑干扰，纯化完马上除盐试试．
纯化后立刻脱盐，有活性了，非常感谢啊！够毕业了，呵呵！大家加油！
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发表于 2014-2-22 20:37 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我his亲和层析后，将各缓冲梯度下的收集液电泳检测蛋白分布，但电泳后什么也没有！不知道是咋回事？？
还有，洗脱时流速是否有严格要求？我的柱子滴的太慢了，我加压了，不知道会不会是这个影响的？
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发表于 2014-2-22 20:38 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
也许你蛋白浓度过低,可以浓缩或沉淀后再跑电泳,可参考一些电泳实验书的样品处理,流速不是很严格,用处1-2ml/min都可以.
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mingming0638[使用道具]
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发表于 2014-2-22 20:39 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
本人用过GE镍凝胶填料和bio-rad的预装柱，就目前实验效果，GE填料效果要更好。
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xiaoxiaoniao[使用道具]
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发表于 2014-2-22 20:41 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

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头痛
现在碰到了非常头疼的事情。
SDS-PAGE电泳时，纯化好后的蛋白没有经过透析直接上样，结果还没跑完浓缩胶，就见溴酚蓝参差不齐，东倒西歪，另外，浓缩不成一条直线。简直可以用大花脸来形容，图我就不上了，情况就是这样的。
我唯一能确定的是所制的浓缩胶是没有问题的，其他的线索就是：我的蛋白样品中含有PMSF（用乙醇溶解），较多的氯化钠，一定量的2-ME以及NP-40，说到NP-40，我昨晚纯化的时候，发现树脂结块现象，我估计是NP-40捣的鬼。
做了一个通宵的实验，身心俱疲啊！如果是蛋白电泳正常跑完后，发现纯化结果不好，我也就算了，可以重新摸索纯化条件，可现在连蛋白电泳都不能正常去跑，实在让我失落啊。请战友们指点迷津！
回答上述问题: 电泳跑不出来,条带发生扭曲,是因为样品中盐浓度过高,建议脱盐后再跑电泳.
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发表于 2014-2-22 20:42 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我也做his标签蛋白的纯化，新买了invitrogen的Ni-NTA Agarose,但是纯化的结果是条带很杂。然后我看说明书说为了减少非特异性吸附，可以在binding buffer里加咪唑，浓度是10mM，所以我就这样做了，菌液也是用binding buffer+10mM重悬破碎的，洗脱我是用binding buffer（10mM）、wash buffer20mM、40mM、60mM各40ml洗脱，然后SDS-page分析各组分，发现binding buffer（10mM）洗下很多目的蛋白，wash buffer20mM、40mM、60mM有一点，elute buffer就没有了，这是怎么回事啊？
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发表于 2014-2-22 20:42 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
是不该用binding buffer+咪唑重悬菌液吗？还有，我的binding buffer洗脱液中有较多目的蛋白，我可以再用来上柱子吗？
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发表于 2014-2-22 20:42 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

你的蛋白也许作用力太弱，如果这样，那你可以在binding buffer别加咪唑，洗脱用2，4，6，8，10mM洗看看能不能好点．总之需要根据实际实验条件修正咪唑的浓度就会有好结果的，可以参考说明书，纯化很难一次就有满意的结果的．
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发表于 2014-2-22 20:43 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

求助：我表达的一个酶蛋白，含有6His 是包涵体，但我用6M盐酸胍变性后，电泳检测啥也没了，但是用脲表性的是可以看到目的蛋白的。
还有，我用的是Ni-NTA树脂，之后我要通过透析复性，大家给点建议，现在能洗脱下目的蛋白的梯度是60mM 和100mM咪唑 复性时设置多大的梯度合适呢？复性完成后用啥来平衡呢？
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 小中大

盐酸胍干扰电泳，需要去掉才能跑电泳。复性没确切的方案，只能自己摸索。
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