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标题:【求助】 6X His标签蛋白的纯化求助

taoshengyijiu[使用道具]
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发表于 2014-2-22 21:39 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

将加还原剂和不加还原剂的同时用纯化前和纯化后的样品跑下电泳，不用做Western，多上点样，跑个PAGE胶就看出来了，试试吧
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mingming0638[使用道具]
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发表于 2014-2-22 21:39 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


QUOTE:
原帖由 taoshengyijiu 于 2014-2-22 21:39 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

将加还原剂和不加还原剂的同时用纯化前和纯化后的样品跑下电泳，不用做Western，多上点样，跑个PAGE胶就看出来了，试试吧


不加还原剂的，即在细胞内表达的蛋白，我没有进行纯化。
加还原剂的，即在蚕体内表达的蛋白，我以前用纯化前和纯化后的样品跑过SDS-PAGE.请看下图，从左边起第一孔道至第四孔道均为洗脱液（最终的纯化后样品），第五孔道为WASH后的流出液，第六孔道为结合后的流出液，第七孔道为结合前的上样液，即所谓的纯化前的样品吧。从图似乎看不出什么结果来。
其实2-ME的作用只是为了防止蚕体血液变黑，加2-ME是不得已而为之。
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mingming0638[使用道具]
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发表于 2014-2-22 21:40 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
今天又做了一遍western，SDS-PAGE所用的溶液除了30%聚丙烯酰胺以及APS外，我都用上了新鲜配制的。发现电泳跑完的时间有所缩短，这是好事，：））
但是western结果还是如出一辙，有很浓的条带，但是比48KD要大，而本人预期的结果在46KD。
我打算近期做个脱盐，时间紧迫，越快越好。脱盐后测下酶活，如果有酶活，那就得了，证明纯化结果还是马马虎虎的，老板那边至少可以有个交代。
脱盐和透析之间，我最终选择了脱盐，用隔壁实验室同学的脱盐设备。
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mingming0638[使用道具]
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发表于 2014-2-22 21:41 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
目前进展：
脱盐后测出样品有纤维素酶活，脱盐后的样品SDS-PAGE分析无条带，这是因为脱盐后纯度提高了，浓度下降了。Western Blot分析有条带，条带大小还是比48KD来的大。重复了3，4次都是同样的结果，看来不用在做了。只是没法说清楚为什么细胞内表达和家蚕体内表达出来的蛋白质大小不一样。很郁闷。哪位战友可以帮我点播一下！万分感激。不然没法毕业了。。。
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daod[使用道具]
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发表于 2014-2-22 21:41 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

各位：
我现在也一直在做纯化，目的蛋白带6-His，可是纯化的结果不怎么纯，我的bing buffer中咪唑的含量是20 mM，elution buffer中咪唑含量是500 mM，作过梯度洗脱，50mM、100mM、200mM，只有在100mM和200mM洗脱是出现蛋白吸收峰，很少，500 mM比较多，但是这样操作能减少杂带，但是最后蛋白还不是特别纯，有什么办法让蛋白更纯吗？
自己装的柱子，填料是国产的。
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wls*^*[使用道具]
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发表于 2021-12-24 22:05 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

回复 #55 daod 的帖子

你好，我现在遇到了同样的问题，bing buffer用的是TBS buffer，washing buffer用的是TBS buffer +10 mM咪唑，elution buffer是TBS buffer +250 mM咪唑，之前提取过一次，那次挺纯的，之后再用一样的方法elution buffer条带很杂，想请教一下您


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chenzhen2016[使用道具]
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发表于 2023-7-17 16:23 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
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chenzhen2016[使用道具]
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发表于 2023-8-8 15:07 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
对于6X His标签蛋白的纯化，你可以考虑使用亲和层析技术，其中Ni-NTA（镍螯合树脂）是常见的选择，因为镍螯合树脂能够特异地与6X His标签结合。以下是一些建议的公司和试剂，以及相关的步骤：

公司推荐：

1. Qiagen: Qiagen提供了许多用于His标签蛋白纯化的试剂盒，例如QIAexpress Ni-NTA蛋白纯化试剂盒。

2. Thermo Fisher Scientific: Thermo Fisher提供Pierce His蛋白纯化产品线，包括列洗蛋白纯化试剂盒等。

3. GE Healthcare: GE Healthcare提供Ni Sepharose等蛋白纯化产品，适用于His标签蛋白纯化。

试剂选择：

1. Ni-NTA树脂： 选择高质量的Ni-NTA树脂，以确保良好的亲和层析效果。

2. 洗脱缓冲液： 通常使用含有梯度浓度的缓冲液来洗脱His标签蛋白。例如，含有250 mM imidazole的缓冲液通常用于洗脱。

3. 洗脱缓冲液的稀释液： 用于将高浓度洗脱缓冲液稀释至适当浓度，以避免直接暴露蛋白于高浓度洗脱缓冲液。

4. 质量控制试剂： 质量控制步骤是确保纯化蛋白质质量的关键。你可能需要BCA或Bradford蛋白定量试剂来确定蛋白浓度。

步骤概述：

1. 表达和收获：使用杆状病毒表达系统表达目标蛋白，确保表达充分。

2. 裂解和提取：裂解细胞并提取蛋白质。使用含有6X His标签蛋白的提取缓冲液。

3. Ni-NTA亲和层析：将提取的蛋白质样品与Ni-NTA树脂混合，充分搅拌，以允许His标签蛋白与树脂结合。

4. 洗脱：使用梯度浓度的洗脱缓冲液洗脱非特异性结合的蛋白质。

5. 纯化评估：分析洗脱样品，可以使用SDS-PAGE或Western blot等方法。

6. 浓缩和稀释：浓缩纯化蛋白质，然后稀释到适当浓度。

7. 存储：将纯化蛋白质分装并存储在适当的条件下。

请注意，每个公司的试剂盒和流程可能会有细微的差异，所以在使用之前务必阅读和遵循所提供的具体操作手册。同时，确保在实验过程中采取适当的生物安全和实验室操作规范。如果你对实验步骤不确定，最好在实验前与实验室同事或导师讨论，以确保获得准确的指导。
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chenzhen2016[使用道具]
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发表于 2023-8-18 16:24 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
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发表于 2023-9-23 19:24 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
求助各位大佬，我用镍珠纯化蛋白时即使用高浓度的咪唑也洗不下来蛋白是因为什么啊？之前的时候是可以洗脱下来的，但是这两次就不行了。
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