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标题:【讨论帖】western blot 中抗体的重复应用问题

orangecake[使用道具]
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发表于 2014-3-10 17:53 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我WESTERN时：
转膜用36V，18MA,20小时。
marker可以转上。
丽春红染色，膜上没有明显的条带，可见蛋白泳道影，向刷子刷得一样。
靠马斯亮蓝染胶，胶上仍可见蛋白条带。
不知问题处在那里？
谢谢！
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33号[使用道具]
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发表于 2014-3-10 17:53 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
0次都没关系,加NaN3,放-20度一年没问题,我这么说,试剂公司可要骂我了,没骗你!!
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greenbee[使用道具]
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发表于 2014-3-10 17:53 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
不知你用的是哪种仪器转膜，
电压和电流是不是太小了？转膜时间太长了。
我们用Bio-Rad公司的转膜仪，如果按稳压条件，
是100V，2小时。
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zsxan1990[使用道具]
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发表于 2014-3-10 17:54 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

如果你的二抗连的是POD，叠氮钠会影响其灵敏度，所以这种情况下不要加
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wmp1234[使用道具]
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发表于 2014-3-10 17:54 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我用的是Bio-rad公司的转膜仪，350mA，一小时，至今没有失败过
关于抗体，最好不要重复使用
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bs4665[使用道具]
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发表于 2014-3-10 17:54 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我的一点意见：
1. 一抗价格很贵的话，可以考虑反复用的。孵育液中，－20反复冻融3－4次做绝对没有明显信号减弱的情况。我在美国的师兄说他们是milk & 叠氮钠 & 4度，用一个月，绝对没问题。
2. 还有一个方法，不知道你们是怎么孵育的？我一抗一般用量很少。10 lanes的膜也只用到2ml孵育液，可以用封口膜，剪一块，对摺，把膜放里面，加上一抗孵育液，然后放在室温或4度，不用shaking的，我们实验室一直这么做，效果很好，很节约。
3. 二抗便宜，我一般就用一次，也用培养皿 & 足够量的孵育液，shaking了。
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发表于 2014-3-10 17:55 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我的一抗用了3到4次后目的条带就开始弱了。
做DAB显色还可以
如果是做ECL，目的条带就明显减弱了。很奇怪哦
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bs4665[使用道具]
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发表于 2014-3-10 17:55 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


QUOTE:
原帖由 am10 于 2014-3-10 17:55 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
我的一抗用了3到4次后目的条带就开始弱了。
做DAB显色还可以
如果是做ECL，目的条带就明显减弱了。很奇怪哦

1. 是的，如果－20度反复冻融的话，4次以后我就不用它做ECL显色的western了。
2. 还有就是抗体本身质量好坏的差异也会造成信号减弱的。我比较过，我买的进口的一抗、国内分装的一抗或自己做的抗体，可以反复使用的次数都不一样。因此，你对自己常用的一抗可以先摸一下条件，看看在相同的其他条件下（上样量、转膜状态、等等）会出现什么情况，以后就可以按照这个条件进行实验了。
3. 所以不是很奇怪的，呵呵。
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orangecake[使用道具]
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发表于 2014-3-10 17:55 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我的一抗用含脱脂奶粉的TBST稀释，能否加叠氮钠？如果可以，加多少？我看上面的帖子有的说0.2％，有的说0.02％。望诸位高手快快告知，明天就要稀释宝贵的一抗了。THANKS.
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nn255[使用道具]
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发表于 2014-3-10 17:56 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
可以，0.02％
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