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标题:【讨论帖】western blot 中抗体的重复应用问题

莲花白[使用道具]
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发表于 2014-3-10 20:29 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
请问５％的ＢＳＡ用什么配啊，是ＰＢＳ还是水啊
另外抗ＧＳＴ的一抗，哪儿卖的又便宜，又好用啊，谢谢

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一般用PBS配，目的是保持一定的缓冲体系。
至于便宜又好用，你说的便宜是指多少钱算便宜?hehe，不介意就联系一下我吧。
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birdfish[使用道具]
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发表于 2014-3-10 20:29 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我近乎于0V，每cm2为0.8mA，转1.5小时就完全了。
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小螺号[使用道具]
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发表于 2014-3-10 20:30 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我转膜都是100v,1hr.80kd以下都应没问题。电压太高，功率太大都不好。如果放在4度冷室或冰箱中转效果会更好，但时间要延长0.5-1小时
还有，我的一抗也是用封闭液配的，4度放一周就成白色悬液了
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ha111[使用道具]
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发表于 2014-3-10 20:30 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
叠氮钠不能用于辣根过氧化物酶标记的抗体 吗？
是这样吗？
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wu11998866[使用道具]
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发表于 2014-3-10 20:31 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

楼上有人指出NaN3不能用于HRP的检测方法，请问是说不能用NaN3配置一抗，还是一抗 二抗都不能配置了？
"叠氮钠能阻断细胞的电子传递链，对许多生物体都有毒性，因此不能用于活体实验；因为含有氨基而能干扰许多标记方法（不过在我的实验里有一步是会受氨基影响的，但在这一步中我做了对照，发现叠氮钠并没有对我的实验产生什么不良影响）；不能用于辣根过氧化物酶标记的抗体。"
谢谢
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发表于 2014-3-10 20:32 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

可以配备一抗,不能配HRP标志的二抗
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tudou85[使用道具]
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发表于 2014-3-10 20:32 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
没有稀释的时候抗体在-20℃下不结冰应该是加了甘油，甘油通常能有效地增强蛋白质的稳定性，并且使蛋白质能在-20℃不结冰状态下保存。我现在用的博士德的抗体产品中含有30%的甘油，你看看你购买的抗体产品的说明书就知道了。
防污染可添加0.02%的叠氮钠，或0.01%的硫柳汞。叠氮钠能阻断细胞的电子传递链，对许多生物体都有毒性，因此不能用于活体实验；因为含有氨基而能干扰许多标记方法（不过在我的实验里有一步是会受氨基影响的，但在这一步中我做了对照，发现叠氮钠并没有对我的实验产生什么不良影响）；不能用于辣根过氧化物酶标记的抗体。而硫柳汞不含氨基，不影响基质的稳定性。
容器壁对蛋白质的非特异性吸附可以造成蛋白质变性，因此在稀释的抗体溶液中加入BSA是很有必要的。
......

=====================

加了甘油不会结冰吗？
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eric930[使用道具]
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发表于 2014-3-10 20:33 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
可见western生命力之顽强。实验室有钱的话，抗体只用一次。我所在的实验室是整张膜加5ml稀释后抗体。
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gogo[使用道具]
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发表于 2014-3-10 20:33 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

看来大家对关于一抗和二抗的重复使用问题都是很关心的啊！有空去看看我以前的帖子讨论的：
cuturl('http://www.dxy.cn/bbs/post/view?bid=65&id=9030865&sty=1')，
只是不知道为什么那个帖子已经不能回复了，请问版主难道回复还有时间限制的吗？
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+小生怕怕+[使用道具]
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发表于 2014-3-10 20:34 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我因为做western blot 总是没结果，就严格按照cell signa的说明书进行操作，将多抗用5%的BSA稀释成10ml后4度冰箱孵育过夜，但是依然无结果。我将稀释后的 抗体准备重复使用，但是原来未稀释前在-20度时抗体不结冰，现在稀释后则结冰，这样用时反复冻融会不会影响结果。还是抗体在稀释后应放4度保存？
另外我想问一下这样的抗体一般可用几次。
如果是在室温下孵育的抗体可不可以重复用，上次我用此抗体，连原来做出来的都未出结果。
......

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抗体稀释前是溶解在甘油当中储存，所以-20度并不会结冰。现在你把抗体稀释后使用，有了水在里面，自然会结冰了。一般说来，抗体可以重复使用几次，但这个次数因人，因抗体，因具体实验而异。如果稀释后的抗体在近期会再使用，那建议4度保存，几天后再次使用。并且反复次数不要超过三次为好。如果隔一段时间再用，那么-20度保存，再次使用后，最好不要再冻回去了，抓紧时间再做两次实验好了。
祝好运！
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