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标题:【讨论帖】western blot 中抗体的重复应用问题

hot_hot_hot[使用道具]
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发表于 2014-3-10 20:34 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
二抗非常便宜，没必要重复使用。
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zhezhe[使用道具]
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发表于 2014-3-10 20:34 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
【1】的确有的一抗可以反复应用很多次的，有的用几次就不好用了。主要跟抗体的特性、质量等有关，跟储存等情况也有关。所以，一种一抗稀释液用多长时间，一般只有用了才知道。
【2】当然用一次也可以的，我就是用一次。每次的用量是400微升～1毫升。效果也是很好的。我就是用塑料袋做成小袋子，然后把膜放到里面，然后把一抗稀释液放到里面。然后用封膜机把口封上。这样一抗稀释液就可以把膜全包上了。
【3】二抗也可以这样用，也是很省的，不用重复应用的。
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发表于 2014-3-10 20:35 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

请问：我所用的封闭液中有NaN3，加一抗、二抗时没有，对结果不会有影响吧？
封闭后反复洗过。
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发表于 2014-3-10 20:35 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
请问：曝光出来的条带效果不好，从条带上可以判断是信号弱还是转膜没转好吗？ 谢谢！
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mamamiya[使用道具]
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发表于 2014-3-10 20:36 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

可以做个考染
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发表于 2014-3-10 20:36 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


QUOTE:
原帖由 mamamiya 于 2014-3-10 20:36 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

可以做个考染

请问怎么做？
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发表于 2014-3-10 20:37 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

大家好：我做wb时，目的蛋白分子量在38-45之间，SDS-PAGE :120v（恒压）;转膜：我是用湿转：120v（恒压），1.5h。你们觉得这个条件怎样？谢谢！
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发表于 2014-3-10 20:37 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

配一抗应该没问题，因为本来就需要彻底洗干净未结合的一抗。
二抗才含有HRP，不能加叠氮纳
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喵咪[使用道具]
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发表于 2014-3-10 20:37 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

买来的一抗里添加有叠氮钠。
我们用的二抗是辣根过氧化物酶标记的，有结果，建议一抗后要洗的干净，没什么大影响。
我们用的是买来的一抗稀释液。
重复利用嘛···会重复利用很多回···在4度保存，一直没出过什么问题（当然也可能出了问题，我们没发现）。
二抗用封闭剂稀释。
封闭剂是5%脱脂奶粉，用TBST溶解。
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喵咪[使用道具]
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发表于 2014-3-10 20:38 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
大家好：我做wb时，目的蛋白分子量在38-45之间，SDS-PAGE :120v（恒压）;转膜：我是用湿转：120v（恒压），1.5h。你们觉得这个条件怎样？谢谢！
120v 1.5h 应该会转过，你可以用两张膜。
转移不可能做到100%都转到膜上，用两张膜转，转完后用立春红染膜，看有没有转过，转过多少···也可以用考马斯染胶，看有多少残留。根据结果再做调整。
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