蛋白质与蛋白组学 » 讨论区 » 经验共享 » 【讨论帖】western blot 中抗体的重复应用问题

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标题:【讨论帖】western blot 中抗体的重复应用问题

wu11998866[使用道具]
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发表于 2014-3-10 20:38 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我们实验室都是用TBST配成5%的牛奶,再用牛奶配一抗或二抗的,加点叠氮钠可以4度放一个月没问题的
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xueyouzhang[使用道具]
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发表于 2014-3-10 20:40 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

请问，是不是封闭和洗膜的结果有很大影响呢？
我做了几个月的WB了，结果总是不稳定，时有时无，虽然有条带，但是却没有趋势。而且背景很深，刚刚换了单抗。听有经验的师兄师姐说，封闭过长会封闭掉目的蛋白，洗膜过短，背景深，洗膜过长的话就会把抗体也洗掉。真的会这样嘛？
还有洗膜TBST里tween20的浓度一般是多少啊？
谢谢各位！
做了很久了，一直没有想要的结果，很着急，现在有点走火入魔了，呵呵！怀疑每一个细节了。
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yes4[使用道具]
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发表于 2014-3-10 20:40 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

二抗不能重复利用，即便抗体部分不降解，HRP也会很快降解。二抗甚至不能4度过夜孵育。
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dreaming[使用道具]
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发表于 2014-3-10 20:42 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我都是用一张塑料膜铺在玻璃板上，再放上膜，膜上加稀释的一抗，这样很省抗体，一次大概800微升的稀释液就可以了。所以一直也没有回收过一抗
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