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标题:【求助】western blot 和 RT-PCR呈相反趋势怎么回事?

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QUOTE:
原帖由 c86v 于 2014-3-13 11:26 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

正如楼上所说,你可以把实验及结果在具体讲一讲,这样分析起来才会更有的放矢。另外我提到的严格的内参或对照,是指不管参照还有目的蛋白或mRNA都不能过饱和,正象iris_palm帖得图,下面的对照就是不合适的,要选择和目的蛋白或 ...

如何防止WB时的过饱和现象?
先谢谢了
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c86v[使用道具]
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理想状况是选择和目的蛋白相似丰度的参照, 当然抗原抗体反应强度也要类似。另外可以通过梯度稀释样品找到合适曝光的WB,防止过饱和。
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remenb[使用道具]
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如何选择与目的蛋白相似丰度的内参啊?
"另外可以通过梯度稀释样品找到合适曝光的WB,防止过饱和。"
什么是合适曝光的WB?
能否说的详细一些啊?
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yueban-1147[使用道具]
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我看过类似结果的paper的.RNA水平和蛋白质水平不一致是很正常的现象.
很有可能原因是你的目的蛋白受到另一个蛋白的调空:稳定这个蛋白或介导泛素化降解.
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c86v[使用道具]
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选择与目的蛋白相似丰度的内参只能是查目的蛋白相关文献,看它大致的表达量,然后从相关文献中查找类似表达量的蛋白作参照。合适曝光而非过饱和的WB用肉眼很难判断,一定要用类似Bio-Rad ChemiDoc等测量灰度的仪器,总之把梯度稀释参照获得的信号作图来判断什么时候达到平台期,在那之外的定量是不准确的。
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QUOTE:
原帖由 c86v 于 2014-3-13 12:59 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
选择与目的蛋白相似丰度的内参只能是查目的蛋白相关文献,看它大致的表达量,然后从相关文献中查找类似表达量的蛋白作参照。合适曝光而非过饱和的WB用肉眼很难判断,一定要用类似Bio-Rad ChemiDoc等测量灰度的仪器,总之把梯 ...


我还是不知如何去找到平台期???
比如我的目的蛋白是某种细胞中的蛋白A,你的意思是说找这个蛋白在细胞中的常规表达量吗?一般做参照的不是都 ACTIN或者GAPDH吗?如果这个蛋白A的表达量和这些内参的不一致,那怎么办?
另外"总之把梯度稀释参照获得的信号作图来判断什么时候达到平台期" 怎么操作呢? 看不懂,不好意思>
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c86v[使用道具]
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拿蛋白定量举个例子,每个蛋白在UV Spec都有上限与下限灵敏度,在该范围之外的蛋白定量是不准确的,这样说是不是更能帮你理解,20mg/ml和100mg/ml的蛋白如果不稀释直接测定浓度,你觉得结果会可靠吗?
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lz的定量看样子应该没有问题的
我现在做的与lz的相识
但是趋势好象是一样的
有机会交流交流啊
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bring[使用道具]
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呵呵,即使你实验没有问题(内参、定量等等),那RT-PCR和WB的结果相反,有时也正常。
1. mRNA不等于protein:举个经典的例子:
CUGBP2蛋白可以结合COX-2的mRNA,抑制其翻译,但可以稳定COX-2的mRNA:
以此,检测可以发现protein的量降低,但mRNA的量增加。
因此,你要确认你所作的基因,是mRNA起作用,还是protein起作用,如果是protein起作用,那你就只以protein为准即可。
2. RNA及protein的合成及降解速度不一致;
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是不是可以这么解释:
楼主是做的不同发育时期的的一个基因的表达水平。
我们知道在受精卵胚胎阶段,很多基因都是开放的,转录大量的mRNA.这是因为机体需要在一个相对短的时间内合成足量的蛋白以行使功能。随着个体的不断发育,蛋白量的不断积累。到达一定的阶段时,机体不再需要这么多的mRNA来翻译这么多的蛋白了,以一种低水平的mRNA就能满足细胞的需要。注意在这里,蛋白不同于mRNA,蛋白特别是结构蛋白相对来说是稳定的,因此在发育早期,高水平的mRNA高速度的翻译蛋白,蛋白质不会降解掉,而是在为细胞成熟做积累。随着机体的发育,蛋白水平也是在不断积累的,因此细胞自身的调节导致mRNA水平的下降。所以出现了楼主所说的实验现象,完全符合客观事实。打个比方,幼猪时期的体重是绝对比一个成年出栏猪的小吧。为什么肉少啊,肉是什么?蛋白!!!但是幼猪这个时期的mRNA肯定比成年猪的要高啊。mRNA翻译出来的蛋白也就是肉都长到了猪身上,没有掉呢。一个是才几周的积累,一个是几个月长得肉,你说那个的蛋白多。。。。。当然,会有人说是细胞数目的增多,但是我们也可以把一个细胞看成一个个体,这种道理也是存在的。总的来说细胞在发育阶段很多蛋白也是要积累的,当到达一定量的时候mRNA水平下降,我们检测蛋白时发现蛋白高,是因为前期的积累。蛋白并没有降解而是积累起来了。
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