【求助】BL21 和 Rosetta 表达的疑惑 - 经验共享

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标题:【求助】BL21 和 Rosetta 表达的疑惑

misswu61[使用道具]
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发表于 2014-3-17 22:29 资料个人空间短消息加为好友

小中大

很想知道现在表达了没

yyaxw84[使用道具]
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发表于 2014-3-17 22:29 资料个人空间短消息加为好友

小中大

请问一下:
1.
转化后直接挑克隆到50ml培养基中,
养到OD600=0.6-0.8时再加IPTG诱导,
2.
与先挑在小试管养一段时间,再加一
部分菌液到50ml培养液中,OD600到
0.6-0.8时加IPTG诱导,
这两种方法有啥区别呢?
10楼gxumxc:你好,请问分两次培养,
那个含T7 RNA聚合酶的质粒就能重
新形成吗???
我前天直接挑克隆到50ml培养液中,
养到OD=0.8时加IPTG,啥也没诱导出
来!正郁闷.....

birdfish[使用道具]
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发表于 2014-3-17 22:30 资料个人空间短消息加为好友

小中大

本人不太同意“BL21菌株中还带有另外一个质粒，是编码T7RNA聚合酶基因的质粒”的观点，如果是这样的话，从转化了表达质粒的BL21（BE3）菌中抽提的质粒就会有两种质粒，可我还没见过这样。T7RNA聚合酶应该是在BL21（DE3）基因组的DE3区，启动子是lacUV5，同样受是IPTG的诱导。
To fanxing518:两种方法诱导都可以。不同基因的表达，难度不一样，受很多因素的影响，最主要的是基因（蛋白）的特性（大小、密码子、5‘端二级结构等、产物毒性等）、载体的选择，采用何种形式表达（融合or 非融合），如果一个基因实在很难表达（如对菌体有毒性），可以采用融合表达，使之形成包涵体，也许会好些。不同的蛋白要具体分析。不知道有没有人在开发这种预测蛋白表达的软件之类的？
To erwinchen:Rosetta不太适合于规模生产, Rosetta菌种的生长速度会慢些，最主要的是工业化生产中如制药，一般不加抗生素，这样含多个质粒的Rosetta就更不稳定，不好控制发酵工艺。

jude[使用道具]
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发表于 2014-3-17 22:30 资料个人空间短消息加为好友

小中大

我也出现了这样的问题.以前做好了的重组菌,现在拿来诱导,更本诱导不出,而且和BL21菌对照了一下,发现重组菌不表达了.这到底是怎么回事?

bling[使用道具]
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发表于 2014-3-17 22:31 资料个人空间短消息加为好友

小中大

我现在也遇到相同的情况，我的片断长度是1800bp

bling[使用道具]
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发表于 2014-3-17 22:31 资料个人空间短消息加为好友

小中大

我现在也遇到相同的情况，我的片断长度是1800bp，用的是Pet32载体，上个月表达的时候，虽然量少，但还是可以看出表达了，但现在怎么也不表达了，请教同实验室的博士，他说他以前也遇到同样的情况，通过更换培养基的方法解决了，我采用同样的方法，还是没有表达。请有这方面经验的大虾们来帮帮啊！
上面有位同学说是编码T7 聚合酶的质粒丢了，这肯定是不对的。编码T7 RNA聚合酶的基因是整合到宿主菌基因组里面的（Lac操纵子下游），在不加IPTG时，被Lac蛋白阻遏表达，加入IPTG时，能诱导T7 gene的表达，生成的T7RNA聚合酶识别我们转化进去的质粒上的T7 RNA启动子，从而使我们的插入基因大量表达。

njkph[使用道具]
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发表于 2014-3-17 22:32 资料个人空间短消息加为好友

小中大

我最近也遇到这种情况，连续作了三个月都是保种后重新划平板就不表达了，质粒测序也是对的，但一直找不出原因来，今天看了各位的帖子如梦初醒啊，明天重新转化再表达，谢谢各位啊

ha111[使用道具]
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发表于 2014-3-17 22:32 资料个人空间短消息加为好友

小中大

很可能是质粒丢失，BL21很容易丢失质粒，一般质粒都保存在JM109和DH5a中比较稳定。我们实验室也有一些人出现这种情况的！

莲花白[使用道具]
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发表于 2014-3-17 22:33 资料个人空间短消息加为好友

小中大

质粒丢失了，在抗性平板上怎么长的起来？

ROSE李[使用道具]
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发表于 2014-3-17 22:34 资料个人空间短消息加为好友

小中大

我现在遇到相似的问题。我的载体是pET28a和pET32a，连的同一个基因，1.5Kb。在BL21中二者都可以表达，但都不溶。转到rosetta中之后，pET32a仍表达，但还是不溶，而pET28a的竟不表达了。请问这是何故？请大家帮帮忙吧！

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