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标题:【求助】BL21 和 Rosetta 表达的疑惑

sunnyB[使用道具]
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我建议还是换个载体吧 比如PET-28A
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ending[使用道具]
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这个问题好像以前讨论过
做过蛋白表达的90%都会遇到这种问题,为什么会出现这种情况,我个人理解是 1 菌种活力下降 2 在BL21摇菌和保存时蛋白泄露表达,对细菌产生影响 3 在BL21 里质粒被修饰了,在BL21中,质粒不稳定,但原因还不是很明确
解决方法:保存质粒而不是BL21 重组菌,每次准备表达时都用质粒重新转化,挑选高表达菌种进行大量表达。
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sunshine039[使用道具]
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还有要注意的(我的经验):大量摇菌表达前,先要划板挑若干单菌落做小量诱导表达,在上样量相同的情况下,我们能看到他们的表达量是不同的,保存表达量高的单菌落,尽快大摇表达,如果放时间过久,还得划板挑克隆选取表达高的单菌落大摇(虽然都来源于一个单克隆菌,但是划板后每个克隆表达量又有不同,原因不明,望大家赐教),这样能尽可能得到高表达。
另外,选Rosetta的原因,是因为它能满足一些稀有密码子的表达,BL21则不行(导致有些蛋白不表达),所以我们有时候不得不选前者。毕竟能出结果是最重要的
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purrr[使用道具]
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我把转化的板子一直在4度保存着,每次要做的时候就从上面挑一个斑,我觉得也挺方便的,板子存一个月应该没有什么问题的!
要是重新转化质粒,还是很麻烦的,Rosetta那么多抗性,倒个平板都很繁琐
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TAT[使用道具]
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我也遇到 了同样的问题,郁闷呀。到现在也表达不出来 了。
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逗号是句号[使用道具]
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以前BL21能表达,就没必要换到Rosetta中。同意以上多位战友的意见,用新鲜转化的菌!
大量生产的话可以用BL21 DE3 Star,一般来说表达量要高很多。当然载体也是一个因素,但同样的载体一般来说这个菌株的表达量更高. Invitrogen 的说明书上说:
The BL21 (DE3) Star cells contain a mutation in the gene encoding RNaseE (rne131), which is one of the primary enzymes involved with mRNA degradation in E. coli. This mutation significantly improves the stability of mRNA transcripts and thus increases protein production.
mRNA在宿主中的稳定性也是影响表达量的一个因素,这个菌株就是通过提高这一点达到的。
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2541[使用道具]
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这问题我也遇到过,非常郁闷. 只能每次都重新转化.当时为了这个问题耽误了我很长时间.
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okhaha[使用道具]
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BL21中质粒不稳定是因为:BL21不像DH5a,JM109那些克隆用菌一样是DNA酶缺陷型,所以时间一长,BL21中的外源质粒有可能会被降解,而克隆用菌中的质粒则相当稳定。
至于为什么BL21中的外源质粒丢失后,还能在相应抗性的平板上长出来的问题是因为:BL21不是RecA缺陷型。质粒上的抗性基因有可能被整合到菌的基因组上,所以质粒丢失后还能在相应的平板上长出来。
其实很多问题都可能在基因型上找出原因。。
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