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标题:【求助】用pet28a表达不出蛋白]

rxcc33[使用道具]
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发表于 2014-3-27 15:37 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】用pet28a表达不出蛋白]


最近构了一批载体，分别用不同基因片段连到pet28a上。用来原核表达，却怎么也表达不出来。试过不同的iptg浓度以及温度，都没有效果。而且我想那么多载体，连的不同的基因，在同一个条件下怎么一个都表达不出来呢。别人一搞就出来，我死活弄不出来，郁闷啊。
我的操作流程是挑单菌落，接到2ml相关抗性的lb，过夜培养。第二天取60ul接到3ml的lb中，长到od600为0.5-0.6时（因为是新手，取一ml去测浓度了），从中取出1ml（还剩1ml做对照），加iptg（manual上说是到1mM，我也试过不同的浓度，比如0.5mM），继续诱导（温度37，我也试过28，20）3个小时以上(久一点应该没有影响吧)，然后收集对照和诱导后的菌体，加loading buffer，沸水煮几分钟，离心，取上清上样。请大家帮我看看问题出在哪啊。
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发表于 2014-3-27 15:37 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
如果确定载体真的构建成功了，恐怕就是生成包含体了。建议把破壁后沉淀也跑一下电泳，看看是否有目的条代。
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发表于 2014-3-27 15:38 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

而且有的时候，诱导表达的蛋白可溶性部分不多，
SDS-PAGE看不出来。
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rxcc33[使用道具]
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发表于 2014-3-27 15:38 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

哦，那样啊。其实如果我就一个载体表达不出来的话我也就认了，但是一堆载体都表达不了，就让我怀疑是不是我的操作还是什么试剂有问题了，所以我把我的操作过程都列出来，让大家帮我看看有没有问题。
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fsdd817[使用道具]
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发表于 2014-3-27 15:42 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

你构建表达载体后，是否测序确认了，读码框是否正确？
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发表于 2014-3-27 15:42 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
你的操作条件都没有什么问题！你所说的温度，IPTG浓度以及诱导时间都是最常规的条件！
最可能怀疑的地方在你的操作过程中，没有保持无菌，造成有杂菌污染！或者在培养基中没加入kana！
建议你重新涂平板，挑取单克隆，进行诱导表达，条件不用变！同时送菌测序！确定你是否真的把目的基因转进去了！
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yjf1026[使用道具]
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发表于 2014-3-27 15:43 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我也在做pET28a表达,若测序正确,我觉得你应该检查一下你的loading buffer,因pET28a在37度表达量是很大,易形成包涵体,而loading buffer在低温条件下SDS会析出,如未混匀就吸取上清的话,loading buffer中因无SDS而难以溶解包涵体,经离心后包涵体会沉淀至管底,上清电泳就无法检出表达的目的蛋白了.如样品沸水煮后离心之后管底的沉淀明显多于空白对照则十有八九是形成包涵体而loading buffer中无SDS所致.另外沸水煮的时间长一点,如15-20分钟试试!
仅供参考!!
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rxcc33[使用道具]
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发表于 2014-3-27 15:43 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
谢谢大家帮我分析。
因为本室有测序仪，因此我对其中2-3个测过序，读码框是没有问题。我在前引物中加入的是nheI和ndeI，都是直接跟atg即可的吧。
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发表于 2014-3-27 15:46 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

1.你的基因是来源于原核还是真核？可以考虑一下稀有密码子的问题。
2.并不是所有转化表达载体后长出的转化子都可以表达，你可以多挑几个一起诱导看看。
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rxcc33[使用道具]
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发表于 2014-3-27 15:46 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


QUOTE:
原帖由 3648755 于 2014-3-27 15:46 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

1.你的基因是来源于原核还是真核？可以考虑一下稀有密码子的问题。
2.并不是所有转化表达载体后长出的转化子都可以表达，你可以多挑几个一起诱导看看。 ...

我没有考虑稀有密码子呢，影响会很大吗
你的第二点也没有考虑到。但是我同时做多个载体的表达，都弄不出来。而且其中一个蛋白别人用其他载体表达过，表达出来了，对宿主有毒性；我自己诱导，也看得出诱导后菌颜色变暗，感觉也是有毒性的样子。
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