【求助】请WB达人进来帮助分析一下原因吧，有图

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标题:【求助】请WB达人进来帮助分析一下原因吧，有图

惊醒ing[使用道具]
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发表于 2014-4-5 17:38 资料个人空间短消息加为好友

小中大

我是新手。做了2个礼拜了吧，原来一直没有结果，我仔细分析了一下，找不出原因。上园子里广泛搜索，学到了不少东西。猜测可能是转膜时间太短，所以我今天新换了转膜液，延长了时间，今天总算有了吧。不过，对这个结果我很疑惑。图中m代表marker，s代表样品。marker最大位置在118处，下面是65。目的蛋白的分子量是92，santa的产品说明书上写的。从图中可以看到最亮的条带在118以上！！！如果说这条不是我所要的蛋白的话，那么这抗体也太差劲了吧，，，都抗到别的地方去了。如果是我要的，那这位置。。。。
我的参数是：5%浓缩胶，10%分离胶，总共恒压130v,2小时左右。转膜400mA，150分钟。常温5%牛奶封闭过夜，一抗（santa 羊抗鼠多抗）3小时，2抗（HRP标记）3小时。PVDF膜。试剂都是新的。
请大家帮助分析一下吧，谢谢啦。除位置问题帮助分析一下以外，还有什么做的不好的地方，也请一并指正！
国庆节都没法过咯。。。。-_-

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2014-4-5 17:38

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zhezhe[使用道具]
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发表于 2014-4-5 17:39 资料个人空间短消息加为好友

小中大

先搞清楚你的蛋白信息，看看有没有别的isoform,不同isoform的蛋白大小不一样，位置肯定也不一样。然后重复一下你的实验，看是否在同一位置出现带，如果可能，可以设阳性对照。

finger[使用道具]
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发表于 2014-4-5 17:39 资料个人空间短消息加为好友

小中大

先确定你的蛋白大小，才可把握转膜时间等。。。

vtongli[使用道具]
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发表于 2014-4-5 17:39 资料个人空间短消息加为好友

小中大

楼上说得没错,
另外, 会不会是多抗非特异性呢?
二抗是羊抗的吧?
抗体稀释浓度和转膜时间是关键,
但貌似你的问题不是出在这.
阳性对照最好做一做了.

惊醒ing[使用道具]
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发表于 2014-4-5 17:40 资料个人空间短消息加为好友

小中大

可惜没有标准品

xueyouzhang[使用道具]
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发表于 2014-4-5 17:40 资料个人空间短消息加为好友

小中大

400mA 150min的转膜时间够长的
92kD的蛋白没有必要这么久
300mA 90min足够了
二抗没有必要那么长时间 1h就够顶多2h
Marker怎么会显影？

惊醒ing[使用道具]
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发表于 2014-4-5 17:40 资料个人空间短消息加为好友

小中大

我也不明白marker怎么会显影。。。。@_@!
问了几个人说，偶尔是这样的，所以也没在意
昨天问了个牛人，他对这结果也没法解释。首先，电泳没问题，条带跑得很开。转膜也看不出问题，不管时间电压，转上去就行。最后，那三个显然是条带，绝非污染。难道问题在抗体上？？
前几次我用的是350mA，90min，总是不出结果，所以把条件调整了，而且把膜剪大了点，于是。。。。

gemei0115[使用道具]
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发表于 2014-4-5 17:41 资料个人空间短消息加为好友

小中大

个人认为这个结果不太可信.
1. 预染marker显影,这说明你的抗体孵育有问题.如果是室温的话,一抗和二抗时间都太长了.
2. 如果那条亮带是你的目的条带,我认为这个条带至少也在200kD左右了,根据我的经验一般来说分子量越大蛋白条带应该越细(除非表达量特别大的).而你的条带很粗很亮,看起来比较像没有跑开的蛋白条带,因此建议你将染胶图像和染膜的图像都发上来供参考.
建议:
1.重新跑两块胶,一块染胶,一块转膜,确定胶跑得没有问题,新配的试剂并不一定没有问题的,PH不对的,跑不下来的很多的.这一步相当重要,,不然后面一切都是白搭.
2.查询目的蛋白相关信息,不要放弃,说不定这是一个重大的科学发现呢!
希望lz反馈实验结果,以便进一步讨论,祝国庆快乐,实验顺利!

youreyes[使用道具]
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发表于 2014-4-5 17:42 资料个人空间短消息加为好友

小中大

marker分子量我不知道有没有问题
显影是正常的：有的公司专门开发了这样的产品，我用过的。

惊醒ing[使用道具]
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发表于 2014-4-5 17:42 资料个人空间短消息加为好友

小中大

QUOTE:

原帖由 youreyes 于 2014-4-5 17:42 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

marker分子量我不知道有没有问题
显影是正常的：有的公司专门开发了这样的产品，我用过的。

高人！就按你说的做！明天恐怕要配一天的试剂了，有结果我一定贴上来！

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