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标题:【求助】请WB达人进来帮助分析一下原因吧，有图

惊醒ing[使用道具]
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发表于 2014-4-5 17:48 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


QUOTE:
原帖由 Ao7 于 2014-4-5 17:45 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

个人建议：首先：SANTA的抗体很差劲，其特点就是广而不精，就是什么抗体都有，什么抗体都不好用！你最好换个其他厂家的抗体试试，Abcam、BD的都不错。其次：我以前用也遇到过这类情况，胶顶部总有很亮的非特异性带，有人说可能是蛋白二 ...


对了！我这里也有人说是蛋白二聚体！从位置上看差不多正好是2倍的样子。但是后来也觉得有点勉强：因为蛋白是煮过的，并且我保证操作没问题。还有啊，我跑的就是变性胶，应该不会“聚体”了吧。
你说对你的蛋白效果不大，你是什么蛋白阿？我是ACE2。看来你还是我的“前车”呢。ACE2有二聚体吗？
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惊醒ing[使用道具]
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发表于 2014-4-5 17:59 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
10%的分离胶，92kD的蛋白按理应该就是在分离胶的上端啊。个人认为目的蛋白的位置没错，只是楼主把marker的大小弄错了而已

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呵呵，这个可能性不大。后来我用别的marker也跑过，我的marker的位置没错。
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发表于 2014-4-5 17:59 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我们提蛋白是把小组织块从液氮中取出直接加入液体研磨匀浆的
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caihong[使用道具]
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发表于 2014-4-5 17:59 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

从蛋白条带的弯曲方向来看，你的分子量好象标错了,也就是说，你把蛋白分子量大小方向搞反了.你所标记的"?"区域是所有小分子量区域,10%胶不能分离20kD以下蛋白,也就是说你所指示的显色条带实际是"20kd"及其20kD以下的蛋白都跑在了一个band上了,存在非特异性条带就显色了.
最大分子量区域不可能有这么明亮的条带存在(大分子量转膜效率很低;跑电泳后大分子量蛋白丢失非常明显).
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发表于 2014-4-5 18:00 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
是不是蛋白煮的时间或温度不够，煮过的蛋白再跑最好65度5min

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我的意思是煮过的蛋白冻回去了，下次再跑前65度加热5min。
还有你说再做一次发现条带在40kd处，你的样品有没分装，我的经验蛋白最怕反复冻融，会不会降解了，分子量变小了。
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发表于 2014-4-5 18:01 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
从蛋白条带的弯曲方向来看，你的分子量好象标错了,也就是说，你把蛋白分子量大小方向搞反了.你所标记的"?"区域是所有小分子量区域,10%胶不能分离20kD以下蛋白,也就是说你所指示的显色条带实际是"20kd"及其20kD以下的蛋白都跑在了一个band上了,存在非特异性条带就显色了.
最大分子量区域不可能有这么明亮的条带存在(大分子量转膜效率很低;跑电泳后大分子量蛋白丢失非常明显).

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我没有标错，呵呵，很肯定。
“10%胶不能分离20kD以下蛋白,也就是说你所指示的显色条带实际是"20kd"及其20kD以下的蛋白都跑在了一个band上了,存在非特异性条带就显色了.”
你的意思是说20kD以下蛋白不在10%的胶中往下跑么？？所以才聚集在上面？
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惊醒ing[使用道具]
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发表于 2014-4-5 18:02 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我们提蛋白是把小组织块从液氮中取出直接加入液体研磨匀浆的

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我知道有人这样做。我现在很怀疑我先解冻是不是不对，所以才导致结果很糟糕！组织样品到底该怎么处理呢 ？很需要这方面的资料
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bluelake[使用道具]
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发表于 2014-4-5 18:02 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我们通常是把组织样品测完浓度后分别分装，放到-80保存，每次用时取一份。
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biabiade[使用道具]
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发表于 2014-4-5 18:03 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

重复几次看看是否都一样，另外要考虑你所测蛋白丰度问题．
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阿司匹林[使用道具]
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发表于 2014-4-5 18:29 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我知道有人这样做。我现在很怀疑我先解冻是不是不对，所以才导致结果很糟糕！组织样品到底该怎么处理呢 ？很需要这方面的资料

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查阅相关的文献，最好是英文的，一般会有关于组织蛋白提取方法的，包括裂解液的配方什么的
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