蛋白质与蛋白组学 » 讨论区 » 经验共享 » 【求助】蛋白表达量太低

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标题:【求助】蛋白表达量太低

caihong[使用道具]
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发表于 2014-4-10 15:07 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

大家好，我刚开始做大肠杆菌表达蛋白，对你们说的过夜诱导应该怎么做，是诱导完了摇过夜还是中途再补加IPTG呢？还有就是，转接后第二代的对数生长期要怎么判断呢？
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yapuyapu[使用道具]
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发表于 2014-4-10 15:08 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

诱导过夜：我的做法是，先摇菌至od600为0.5左右，然后加入iptg至所要求的浓度（这一步也可以先更换新鲜的培养基，摇十分钟至半小时后再加iptg）然后摇菌过夜就行了。
还有对数生长期最简单的方法是通过测od值实现的。首先就是要绘制生长曲线，od值为纵坐标 ，时间为横坐标绘制。
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yapuyapu[使用道具]
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发表于 2014-4-10 15:08 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我的诱导出现新的情况，加诱导剂后37度1，2，4，6小时sds-page检测发现我的蛋白没有什么变化，而又一个蛋白带却变化明显。
这会是什么原因，难道是我的质粒有问题？
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DONT[使用道具]
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发表于 2014-4-10 15:08 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

novagen的操作手册上有很详细的介绍，建议大家看看！
诱导一般第一天活化菌种，目的基因的质粒和空质粒（对照）都需要，活化以后把菌种放在4度过夜，不可以加甘油，第二天早上按照1%的比例接种，37度培养3h后加1mM的IPTG诱导，一般3h，4h后取样就没有什么区别了，没有必要取那多的样！
如果表达量太低的话，先查查优美有大肠杆菌的稀有密码子，有的话赶紧换表达菌种，比如rosetta2系列的，可以提供大肠杆菌的7个稀有密码子！
如果根本没有表达的话，那就检查以下载体有没有问题！
方便的话可以建议贴个图上来看看！
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wmp1234[使用道具]
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发表于 2014-4-10 15:12 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

新手请教：novagen的操作手册去哪里找啊
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